农业农村部公告 第864号-2-2024 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米nCX-1转化体特异性PCR方法

中国国家标准《转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米nCX-1转化体特异性PCR方法》主要内容总结

• 规定了耐除草剂玉米nCX-1转化体成分的三种检测方法：
  ① ​​实时荧光PCR定性检测​​
  ② ​​实时荧光PCR定量检测​​（转化体拷贝数比值）
  ③ ​​普通PCR定性检测​​
• 适用于玉米及其制品中nCX-1转化体成分的定性与定量检测。

• 包括DNA提取、玉米内标基因检测、抽样方法等国家标准（如农业部1485号公告、1861号公告、2031号公告等）。

• ​​转化体特异性序列​​：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列（5'/3'端）。
• ​​阳性质控品​​：含0.1%~1.0%转基因成分的标准物质或验证样品。
• ​​校准品​​：用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA样品，需含5个有效浓度。
• ​​ΔCt值​​：转化体特异性序列与内标基因Ct值的差值。
• ​​ΔΔCt值​​：试样ΔCt值与阳性定量质控品ΔCt值的差值。

• ​​方法选择​​：根据检测需求选择定性或定量方法。
• ​​试剂与模板通用性​​：三种方法的部分试剂、材料和DNA模板可通用。
• ​​质控品设置​​：需包含阴性、空白和阳性质控品。

• ​​原理​​：通过引物/探针扩增内标基因（zSSIIb）和nCX-1特异性序列，判断是否含转基因成分。
• ​​关键参数​​：
  • ​​引物/探针​​：
    • 内标基因（88 bp）：zSSIIb-3F/zSSIIb-4R/zSSIIb-P
    • nCX-1（87 bp）：nCX-1-qF/nCX-1-qR/nCX-1-P
  • ​​检出限（LOD）​​：0.05%（约20拷贝）。
• ​​结果判定​​：
  • 阳性：内标和nCX-1均扩增（Ct≤36）。
  • ΔΔCt值用于初步判断含量高低（需结合定量方法进一步确认）。

• ​​原理​​：利用校准品绘制标准曲线（Ct值与初始拷贝数对数线性关系），计算试样中nCX-1与内标基因的拷贝数比值。
• ​​关键参数​​：
  • ​​定量限（LOQ）​​：0.1%（约40拷贝）。
  • ​​校准品制备​​：需涵盖5个浓度梯度，最高浓度高于试样。
• ​​结果计算​​：
  • 公式法计算拷贝数比值，结合标准不确定度（预评定值或实验室自评）报告扩展不确定度（95%置信度）。
  • 结果需满足阳性定量质控品偏差和变异系数要求（如相对偏差≤25%）。

• ​​原理​​：通过普通PCR扩增特异性片段（172 bp），电泳检测是否存在目标条带。
• ​​关键参数​​：
  • ​​引物​​：nCX-1-F/nCX-1-R（预期片段172 bp）。
  • ​​检出限（LOD）​​：0.1%。
• ​​结果验证​​：必要时通过测序确认扩增片段与附录A序列一致。

• ​​附录A​​：提供nCX-1转化体特异性序列：
  • ​​实时荧光PCR扩增序列​​（87 bp）：包含引物/探针结合区域。
  • ​​普通PCR扩增序列​​（172 bp）：包含引物结合区域及玉米基因组序列。

• ​​质控品设置​​：每批次检测需包含阴性、空白和阳性质控品。
• ​​数据合格标准​​：
  • 阳性/阴性/空白质控品需符合预期扩增结果。
  • 标准曲线决定系数（R²）≥0.98，斜率范围-3.1~-3.6。

• ​​阳性​​：检测出nCX-1成分，定量结果需标注不确定度（如0.5%±0.2%）。
• ​​阴性​​：未检测出nCX-1或玉米DNA。

​​总结​​：该标准系统规范了nCX-1转基因玉米的检测流程，涵盖定性与定量方法，强调质控、数据验证及结果解释，适用于市场监管、科研及进出口检验等领域。