SN/T 1088-2024 布鲁氏菌病检疫技术规范 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T1088—2024
代替SN/T1088—2010,SN/T2436—2010,SN/T3506—2013
布鲁氏菌病检疫技术规范
Quarantineprotocolforbrucellosis
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语与定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 疾病概述………………………………………………………………………………………………… 1
5 临床症状与病理变化…………………………………………………………………………………… 1
6 生物安全措施…………………………………………………………………………………………… 1
7 病原鉴定………………………………………………………………………………………………… 1
7.1 显微镜检查………………………………………………………………………………………… 1
7.2 细菌培养…………………………………………………………………………………………… 2
7.3 多重聚合酶链式反应(多重PCR)………………………………………………………………… 2
7.4 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)……………………………………………………… 5
8 血清学试验……………………………………………………………………………………………… 8
8.1 虎红平板凝集试验(RBT) ………………………………………………………………………… 8
8.2 缓冲平板凝集试验(BPAT) ……………………………………………………………………… 9
8.3 试管凝集试验(SAT) ……………………………………………………………………………… 9
8.4 补体结合试验(CFT) ……………………………………………………………………………… 9
8.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)……………………………………………………………………… 10
8.6 荧光偏振试验(FPA)……………………………………………………………………………… 10
8.7 琼脂扩散试验(AGID)…………………………………………………………………………… 11
8.8 全乳环状试验(MPT) …………………………………………………………………………… 13
附录A (资料性) 疾病概述……………………………………………………………………………… 14
附录B(资料性) 临床症状与病理变化………………………………………………………………… 15
附录C(规范性) 试剂的配制…………………………………………………………………………… 17
Ⅰ
SN/T1088—2024
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替SN/T1088—2010《布氏杆菌检疫技术规范》、SN/T2436—2010《山羊和绵羊布鲁氏菌病
检疫规程》、SN/T3506—2013《布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程》,与SN/T1088—2010、SN/T2436—
2010、SN/T3506—2013相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
———删除了聚合酶链反应(见SN/T1088—2010的5.3);
———增加了多重聚合酶链式反应(见7.3);
———增加了实时荧光聚合酶链式反应(见7.4);
———增加了试管凝集试验微量法(见8.3.2)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国天津海关。
本文件主要起草人:王玉玲、王建华、张俊哲、刘誉、马鑫淼、赵丹、陈本龙、柴铭骏、王乃福、陈小金、
刘培、刘洋。
本文件所代替文件的历次版本发布情况为:
———SN/T1088,2002年首次发布,2010年第一次修订,修订时并入了SN/T1089—2002《布氏杆
菌病补体结合试验操作规程》、SN/T1090—2002《布氏杆菌病试管凝集试验操作规程》、
SN/T1394—2004《布氏杆菌病全乳环状试验方法》、SN/T1525—2005《布氏杆菌病微量补体
结合试验方法》;
———SN/T2436,2010年首次发布;
———SN/T3506,2013年首次发布。
Ⅲ
SN/T1088—2024
布鲁氏菌病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了布鲁氏菌病的显微镜检查、细菌培养、多重聚合酶链式反应(多重PCR)、实时荧光聚
合酶链式反应(实时荧光PCR)、虎红平板凝集试验、缓冲平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、
酶联免疫吸附试验、荧光偏振试验、琼脂扩散试验、全乳环状试验等诊断技术。
本文件适用于布鲁氏菌病的临床诊断和实验室检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18646 动物布鲁氏菌病诊断技术
GB19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 疾病概述
见附录A。
5 临床症状与病理变化
见附录B。
6 生物安全措施
为了保护实验室人员和环境的安全,应由具备资格的工作人员进行布鲁氏菌病原鉴定和血清学检
验,应采取预防气溶胶感染的安全防护措施。所有培养物和废弃物应经高压灭菌后处置。病原分离培
养工作应在生物安全三级实验室中进行。生物安全措施应按照GB19489中的有关规定执行。
7 病原鉴定
7.1 显微镜检查
显微镜检查方法按GB/T18646执行。
1
SN/T1088—2024
7.2 细菌培养
细菌培养方法按GB/T18646执行。
7.3 多重聚合酶链式反应(多重PCR)
7.3.1 仪器和设备
高速低温离心机、手掌式台式离心机、PCR扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像分析仪、水浴锅、漩涡振
荡器、可调移液器。
7.3.2 试剂和材料
7.3.2.1 细菌基因组DNA 提取试剂盒。
7.3.2.2 布鲁氏菌质控菌株:猪种布鲁氏菌标准菌株或其模板DNA。
7.3.2.3 10×Taqbuffer、dNTP混合液(2.5mmol/L,含镁离子)、Taq HS聚合酶(250U,5U/μL)或
其他适合的商品化的PCR试剂,5kbDNA 分子质量标准(5kbDNA marker)。
7.3.2.4 TE缓冲液、1×电泳缓冲液(1×TBE)、GelRed或其他适合的商品化的安全无毒核酸凝胶染色
试剂、10×加样缓冲液或其他适合的商品化加样缓冲液,按附录C配制。
7.3.2.5 琼脂糖。
7.3.2.6 试验用双蒸水(ddH2O):符合GB/T6682中的二级水。
7.3.2.7 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。
7.3.2.8 PCR反应管。
7.3.3 操作步骤
7.3.3.1 样品制备
7.3.3.1.1 标准菌株:用无菌接种环挑取单个布鲁氏菌质控菌株菌落,放入200μL无菌双蒸水。
7.3.3.1.2 样品:可疑布鲁氏菌培养物,用接种环挑取单个可疑菌落于200μL无菌双蒸水。
7.3.3.2 DNA 模板的提取
将7.3.3.1制备的菌悬液80 ℃灭活2h,按适合的基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取模板
DNA,然后12000r/min离心20s,取上清液作为PCR 扩增时模板DNA(DNA 浓度为0.1μg/μL~
0.05μg/μL)。
7.3.3.3 引物
PCR引物序列见表1。
表1 PCR 引物序列
序号引物序列5'→3' 扩增片段大小/bp
1 BMEI0998—F ATC-CTA-TTG-CCC-CGA-TAA-GG 1682(2524a)
BMEI0997—R GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT-AGC
2 BMEI0535—F GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATG-AA 450(1320b)
BMEI0536—R CGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CTA-TAA
2
SN/T1088—2024
表1 PCR 引物序列(续)
序号引物序列5'→3' 扩增片段大小/bp
3 BMEII0843—F TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAG-CA 1071
BMEII0844—R GCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TGA-TG
4 BMEI1426—F TCG-TCG-GTG-GAC-TGG-ATG-AC 774
BMEI1427—R ATG-GTC-CGC-AAG-GTG-CTT-TT
5 BMEII0428—F GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACT-GG 587
BMEII0428—R AAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-CG
6 BR0953—F GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTT-GT 272
BR0953—R GAT-GGA-GCA-AAC-GCT-GAA-G
7 BMEI0752—F CAG-GCA-AAC-CCT-CAG-AAG-C 218
BMEI0752—R GAT-GTG-GTA-ACG-CAC-ACC-AA
8 BMEII0987—F CGC-AGA-CAG-TGA-CCA-TCA-AA 152
BMEII0987—R GTA-TTC-AGC-CCC-CGT-TAC-CT
9 BMISPEC—F AGA-TAC-TGG-AAC-ATA-GCC-CG 510
BMISPEC—R ATA-CTC-AGG-CAG-GAT-ACC-GC
a 扩增牛种布鲁氏菌疫苗株RB51时片段大小为2524bp。
b 扩增海洋种时片段大小为1320bp。
7.3.3.4 反应体系
PCR反应体系见表2。
表2 PCR 反应体系
成分体积
10×PCRBuffer 2.5μL
2.5mmol/LdNTP混合液(含镁离子) 2.0μL
引物混合液[5μmol/(L·条)] 2.5μL
ddH2O 16.75μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25μL
模板DNA 1.0μL
注:引物混合液[5μmol/(L·条)]指每条引物在混合液中的浓度为5μmol/L,9对引物先配制成混合液再加入
体系中。
PCR反应管中依次加入上述成分,充分混匀后,瞬时离心。反应总体积为25μL。
同时设立阳性对照、阴性对照,用猪种布鲁氏菌标准菌株的模板DNA 作阳性对照,用无菌水作阴
性对照。
循环条件:95℃预变性7min,94℃变性30s,58℃退火90s,72℃延伸3min,共30个循环,72℃
延伸6min,4℃下保存。
3
SN/T1088—2024
7.3.3.5 PCR 扩增产物电泳检测
取1.5g琼脂糖,加入100mL电泳缓冲液加热溶解,加入GelRed或其他适合的安全无毒核酸凝胶
染色试剂终浓度为1×,制胶,将7μL的Marker和PCR 扩增产物分别与适量的加样缓冲液混合,点
样。120V,电泳60min左右,凝胶成像分析系统检测并记录结果。
7.3.3.6 结果判定
当阳性对照在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带,阴性对照不
出现条带时,试验成立,可进行被检样品的判定。表3对判定结果进行了归纳。
a) 被检样品在1682bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为牛种布鲁氏菌
(B.abortus);
b) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为羊种布
鲁氏菌(B.melitensis);
c) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带时,判定为
猪种布鲁氏菌(B.suis);
d) 被检样品在1682bp、1071bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带时,判定为犬种布
鲁氏菌(B.canis);
e) 被检样品在1071bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为绵羊种布鲁氏菌
(B.ovis);
f) 被检样品在2524bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为牛种布鲁氏菌疫苗
株RB51(vaccinestrainB.abortus RB51);
g) 被检样品在1682bp、774bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为牛种布鲁氏菌疫苗株S19
(vaccinestrainB.abortusS19);
h) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、218bp、152bp处出现条带时,判定为
羊种布鲁氏菌疫苗株Rev1(vaccinestrainB.melitensis Rev1);
i) 被检样品在1682bp、1320bp、1071bp、774bp、587bp、152bp处出现条带时,判定为海洋哺
乳动物种布鲁氏菌(Brucellaisolatedfrom marinemammal);
j) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、272bp处出现条带时,判定为沙林鼠
种布鲁氏菌(B.neotomae)。
k) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、510bp、450bp、272bp、152bp处出现条带
时,判定为田鼠种布鲁氏菌(B.microti)。
l) 被检样品在1682bp、774bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带时,判定为人种布鲁
氏菌(B.inopinata)。
表3 结果判定
布鲁氏菌种
扩增片段大小/bp
152 218 272 450 510 587 774 1071 1320 1682 2524
条带
数量
牛种+ - - + - + + - - + - 5
羊种+ - - + - + + + - + - 6
猪种+ - + + - + + + - + - 7
犬种+ - + + - + - + - + - 6
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表3 结果判定(续)
布鲁氏菌种
扩增片段大小/bp
152 218 272 450 510 587 774 1071 1320 1682 2524
条带
数量
绵羊种+ - - + - + + + - - - 5
RB51疫苗株+ - - + - + + - - - + 5
S19疫苗株+ - - + - - + - - + - 4
Rev1疫苗株+ + - + - + + + - + - 7
海洋种
哺乳动物+ - - - - + + + + + - 6
沙林鼠种- - + + - + + + - + - 6
田鼠种+ - + + + + + + - + - 8
人种+ - + + - + + - - + - 6
注:“+”为出现条带,“-”为未出现条带。
7.4 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)
7.4.1 通用型荧光PCR
7.4.1.1 仪器和设备
高速低温离心机、普通台式离心机、荧光PCR仪、水浴锅、漩涡振荡器、可调移液器。
7.4.1.2 试剂和材料
7.4.1.2.1 细菌基因组DNA 提取试剂盒或组织和全血基因组DNA 提取试剂盒或用于奶样基因组
DNA 提取试剂盒。
7.4.1.2.2 猪种布鲁氏菌标准菌株或其模板DNA。
7.4.1.2.3 反应液:PremixExTaq(probeqPCR)浓度2×或其他适合的商品化荧光PCR反应液。
7.4.1.2.4 试验用水(H2O):无核酸酶水或符合GB/T6682中的三级水。
7.4.1.2.5 荧光PCR反应管。
7.4.1.2.6 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。
7.4.1.3 操作步骤
7.4.1.3.1 样品制备
见7.3.3.1。
7.4.1.3.2 DNA 模板的提取
将7.3.3.1制备的菌悬液或增菌液或阴道分泌物、全血、奶液、子宫或脾组织均质液等检疫样品
80℃灭活2h,按适合的基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取DNA,12000r/min离心20s,取上
清液作为荧光PCR反应模板DNA。
7.4.1.3.3 引物和探针序列
上游引物(IS117-F1):5'-CGCTCGCGCGGTGGAT-3'。
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下游引物(IS117-R1):5'-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3'。
探针(IS117-P1):FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-BHQ1。
7.4.1.3.4 反应体系
通用型荧光PCR反应体系见表4。
表4 通用型荧光PCR 反应体系
成分体积
2×PremixExTaq(probeqPCR) 12.5μL
2.5μmol/L探针2.0μL
10μmol/L上游引物0.75μL
10μmol/L下游引物0.75μL
H2O 8.0μL
模板DNA 1.0μL
注:菌悬液样品提取的模板DNA用量1.0μL;检疫样品提取的模板DNA用量9.0μL。
反应管中依次加上述成分于管底,封严管口。反应总体积为25μL。
同时设立阳性对照、阴性对照,用猪种布鲁氏菌标准菌株的模板DNA 作阳性对照,用无菌水作阴
性对照。
反应参数:95℃预变性10min,95℃15s,60℃60s,45个循环。
7.4.1.3.5 结果判定
7.4.1.3.5.1 结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点,不同仪器
可根据仪器噪声情况进行调整。
7.4.1.3.5.2 质控标准
阴性对照应无Ct值或Ct值>40.0;阳性对照的Ct值应<40.0,并出现典型的扩增曲线。否则,此
次试验视为无效,需重复试验。
7.4.1.3.5.3 结果描述及判定
无Ct值并且无扩增曲线或Ct值>40.0,表示样品中无布鲁氏菌,判定为阴性。
Ct值<38.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在布鲁氏菌,判定为阳性。
38.0≤Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中可能存在布鲁氏菌,需重复试验。重复试
验结果仍为38.0≤Ct值≤40.0,或者Ct值<38.0,判定为阳性,否则,判定为阴性。
7.4.2 鉴别型荧光PCR
7.4.2.1 仪器和设备
高速低温离心机、普通台式离心机、荧光PCR仪、水浴锅、漩涡振荡器、可调移液器。
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SN/T1088—2024
7.4.2.2 试剂和材料
7.4.2.2.1 细菌基因组DNA 提取试剂盒或组织和全血基因组DNA 提取试剂盒或用于奶样基因组
DNA 提取试剂盒。
7.4.2.2.2 猪种布鲁氏菌标准菌株或模板DNA。
7.4.2.2.3 反应液:PremixExTaq(probeqPCR)浓度2×或其他适合的商品化的荧光PCR反应液。
7.4.2.2.4 试验用水(H2O):无核酸酶水或符合GB/T6682中的三级水。
7.4.2.2.5 荧光PCR反应管。
7.4.2.2.6 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。
7.4.2.3 操作步骤
7.4.2.3.1 样品制备
见7.3.3.1。
7.4.2.3.2 DNA 模板的提取
将7.3.3.1制备的菌悬液或增菌液或阴道分泌物、全血、奶液、子宫或脾组织均质液等检疫样品80℃灭
活2h,按适合的基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取DNA,12000r/min离心20s,取上清液作为
荧光PCR反应模板DNA。
7.4.2.3.3 引物和探针序列
引物和探针序列见表5。
表5 引物和探针序列
序号菌种引物引物序列5'→3' 探针序列5'→3'
1 羊种BMEII0466—F TCGCATCGGCAGTTTCAA FAM-CCTCGGCATGGCCCGCAA-BHQ-1
BMEII0466—R CCAGCTTTTGGCCTTTTCC
2 牛种BruAb2_0168—F GCACACTCACCTTCCACAACAA FAM-TGGAACGACCTTTGCAGGCGAG
ATC-BHQ1
BruAb2_0168—R CCCCGTTCTGCACCAGACT
3 猪种BR0952—F CCTGCAAAAAGCAGGAACCA FAM-ATATGGCCGGCTATCCGCGTTCG -
BHQ1
BR0952—R CCTCCGCCAGTCGTGAAA
4 绵羊种BOV_A0504—F CGCTATCGATGGCGTAGTTG FAM-TGGCCTGACGGACGCGCTTATCBHQ-
1
BOV_A0504—R CCCTGATTTCAAGCCATTCC
5 犬种BMEII0635-0636—F AAAATGCGGATCGGCCTT FAM-CCACGGCTTTCGCTCGGGC-BHQ1
BMEII0635-0636—R TCCCGGCGCATTGCT
7.4.2.3.4 反应体系
鉴别型荧光PCR反应体系见表6。
7
SN/T1088—2024
表6 鉴别型荧光PCR 反应体系
成分体积
2×PremixExTaq(probeqPCR) 12.5μL
2.5μmol/L探针2.0μL
10μmol/L上游引物0.75μL
10μmol/L下游引物0.75μL
H2O 8.0μL
模板DNA 1.0μL
注:菌悬液样品提取的模板DNA用量1.0μL;检疫样品提取的模板DNA用量9.0μL。
反应管中依次加上述成分于管底,封严管口。反应总体积为25μL。
依据样品检测目标物数量,选取若干个反应管。检测羊种布鲁氏菌时在管中加入序号1引物和探
针,检测牛种布鲁氏菌时在管中加入序号2引物和探针,检测猪种布鲁氏菌时在管中加入序号3引物和
探针,检测绵羊种布鲁氏菌时在管中加入序号4引物和探针,检测犬种布鲁氏菌时在管中加入序号5引
物和探针。
同时设立阳性对照、阴性对照,用猪种布鲁氏菌标准菌株的模板DNA 作阳性对照,用无菌水作阴
性对照。
反应参数:95℃预变性10min,95℃15s,60℃60s,45个循环。
7.4.2.3.5 结果判定
7.4.2.3.5.1 结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点,不同仪器
可根据仪器噪声情况进行调整。
7.4.2.3.5.2 质控标准
阴性对照应无Ct值或Ct值>40.0;阳性对照的Ct值应<40.0,并出现典型的扩增曲线。否则,此
次试验视为无效,需重复试验。
7.4.2.3.5.3 结果描述及判定
无Ct值并且无扩增曲线或Ct值>40.0,表示样品中无相应种的布鲁氏菌。
Ct值<38.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在相应种的布鲁氏菌。
38.0≤Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中可能存在相应种的布鲁氏菌,需重复试验。
重复试验结果仍为38.0≤Ct值≤40.0,或Ct值<38.0,表示样品中存在相应种的布鲁氏菌,否则,表示
样品中无相应种的布鲁氏菌。
8 血清学试验
8.1 虎红平板凝集试验(RBT)
虎红平板凝集试验方法按照GB/T18646执行。
8
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8.2 缓冲平板凝集试验(BPAT)
8.2.1 仪器和设备
可调微量移液器。
8.2.2 试剂和材料
8.2.2.1 抗原:按说明书使用。
8.2.2.2 阳性对照血清、阴性对照血清:均为冻干品,使用前按说明用蒸馏水溶解至规定容积。
8.2.2.3 玻璃板:约45cm×30cm,要求洁净,划成32个方格,横数8个格,纵数4个格,每格4cm×
4cm,每一格下再划1cm 宽的小格,用于填写血清号。
8.2.2.4 洁净的玻璃小棒或塑料小棒或灭菌扁形圆头牙签。
8.2.2.5 移液器滴头:200μL。
8.2.3 操作步骤
8.2.3.1 试验前将抗原和血清置室温(22±4)℃30min~60min。
8.2.3.2 将玻璃板上各格标上被检血清号,然后加入相应的被检血清80μL。同时作阳性血清和阴性
血清对照,对照血清的加样量同被检血清。
8.2.3.3 将缓冲平板凝集抗原轻轻充分摇匀,在被检血清旁加30μL。
8.2.3.4 用小棒或牙签混匀被检血清和抗原,使之形成直径约3cm 的圆形或椭圆形液区。
8.2.3.5 将玻璃板旋转3次,以使血清与抗原均匀散开。室温(22±4)℃下湿盒内孵育4min。
8.2.3.6 取出反应板,重复8.2.3.5。
8.2.3.7 取出板,边旋转边观察凝集情况。
8.2.3.8 每次操作以不超过20份血清样品为宜,以免样品干燥而不易观察结果。
8.2.3.9 结果判定:当阴性血清对照不出现凝集(-),阳性血清对照出现凝集(+)时,则试验成立,可以
判定,否则试验应重做。出现肉眼可见凝集现象(出现凝块或颗粒物)者判为阳性(+),不出现凝集者判
为阴性(-)。
8.3 试管凝集试验(SAT)
8.3.1 常量法
按照GB/T18646执行。
8.3.2 微量法
按照GB/T18646执行。
8.4 补体结合试验(CFT)
8.4.1 常量法
按照GB/T18646执行。
8.4.2 微量法
按照GB/T18646执行。
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SN/T1088—2024
8.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)
8.5.1 间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)
按照GB/T18646执行。使用商品化I-ELISA 抗体检测试剂盒时,按相应说明书使用。
8.5.2 竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)
按照GB/T18646执行。使用商品化C-ELISA 抗体检测试剂盒时,按相应说明书使用。
8.6 荧光偏振试验(FPA)
8.6.1 原理
溶液中的分子做随机转动。分子的大小是影响转动速率的主要因素,与其成反比关系,也就是小分
子比大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素,通过68.5°角度的转动时间即可通过测量水平和垂
直的偏振光强度来确定。因而,大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。当样品中有目标抗体
时,加入标记荧光素的抗原后,与其发生抗原抗体结合而降低了分子的转动速度,通过测量偏振光的强
度判定样品的阴性、阳性。
8.6.2 仪器和设备
荧光偏振分析仪、可调微量移液器、平板振荡器。
8.6.3 试剂和材料
8.6.3.1 阳性对照:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.2 阴性对照:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.3 25×浓缩的反应缓冲液:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.4 结合物:标记有异硫氰荧光素的O 型多糖(OPS)抗原,布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.5 试验用水:符合GB/T6682中的三级水。
8.6.3.6 微量板:96孔,黑色平底。
8.6.3.7 微量移液器滴头:200μL。
8.6.4 操作步骤
8.6.4.1 将试剂和样品恢复至室温(18℃~26℃)。
8.6.4.2 将25×浓缩反应缓冲液用蒸馏水做1∶25稀释,制备稀释的反应缓冲液避免有颗粒物,稀释
后的缓冲液放置常温保存,并在1个月内使用。
8.6.4.3 被检血清样品中应避免含有颗粒物,如出现颗粒物应做离心处理。
8.6.4.4 取20μL阴性对照加入微量板A1、B1、C1孔中。
8.6.4.5 取20μL阳性对照加入微量板D1孔中。
8.6.4.6 取20μL血清样品加入微量板其余相应孔中。在向微量板加样或加液体时应避免气泡产生。
8.6.4.7 取180μL稀释的反应缓冲液加入微量板的每个反应孔中,置振荡器上中速振荡2min。
8.6.4.8 将反应板置室温(18℃~26℃)孵育3min~5min后,置荧光偏振仪(激发波长485nm,发射
波长528nm)上读取缓冲液和样品的初始值,作为空白偏振值。
8.6.4.9 取10μL结合物加入每个反应孔中,置振荡器上中速振荡2min。
8.6.4.10 将反应板置室温(18℃~26℃)孵育2min~3min,置荧光偏振仪上读取最终偏振值。
8.6.4.11 结果判定:对照或样品的偏振值计算见式(1)。
10
SN/T1088—2024
FP =A -B …………………………(1)
式中:
FP ———对照或样品的偏振值,单位为毫偏振(mP);
A ———对照或样品的最终偏振值,单位为毫偏振(mP);
B ———对照或样品的初始偏振值,单位为毫偏振(mP)。
当阳性对照的偏振值为120mP~250mP,阴性对照的偏振值为70mP~95mP时,方可进行被检
样品的结果判定。若阳性对照或阴性对照的偏振值超出规定的范围,需要根据仪器手册的说明重新校
正仪器。
结果判定计算见式(2)。
Δ =FP -C …………………………(2)
式中:
Δ ———样品的偏振值与阴性对照平均偏振值的差值,单位为毫偏振(mP);
FP———对照或样品的偏振值,单位为毫偏振(mP);
C ———阴性对照的平均偏振值,单位为毫偏振(mP)。
被检样品为牛血清时,Δ<10mP,样品判为阴性;10mP≤Δ≤20mP,样品判为可疑;Δ>20mP,样品
判为阳性。
被检样品为羊血清时,Δ<10mP,样品判为阴性;10mP≤Δ≤15mP,样品判为可疑;Δ>15mP,样品
判为阳性。
被检样品为猪血清时,Δ<10mP,样品判为阴性;10mP≤Δ≤20mP,样品判为可疑;Δ>20mP,样品
判为阳性。
可疑样品应双份重复试验。若两次样品的Δ 均小于10mP,判为阴性;若有一次样品的Δ 在可疑
值范围内或大于阳性值范围,判为可疑,应采用其他试验进行确证;若两次样品的Δ 均大于阳性值范
围,判为阳性。
8.7 琼脂扩散试验(AGID)
8.7.1 仪器和设备
水浴锅、可调微量移液器。
8.7.2 试剂和材料
8.7.2.1 琼脂糖:分析纯。
8.7.2.2 氯化钠:分析纯。
8.7.2.3 硼酸盐缓冲液:硼酸12.4g(分析纯)、氯化钾14.5g、蒸馏水1600mL,用0.2mol/L氢氧化钠
调pH 至8.3±0.02,最后补加蒸馏水至2000mL。
8.7.2.4 阳性对照血清。
8.7.2.5 抗原。
8.7.2.6 平皿:规格90mm×15mm,一次性平皿或洁净灭菌的玻璃平皿。
8.7.2.7 七孔打孔器:孔径3mm,孔距3mm。
8.7.2.8 移液器滴头:200μL。
8.7.3 操作步骤
8.7.3.1 琼脂平板的制备
分别取琼脂糖1g、氯化钠10g、硼酸盐缓冲液100mL,加入三角瓶中,在水浴中充分煮沸溶解,冷
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SN/T1088—2024
却至56℃左右,将平皿置于水平台上,在每个平皿中加入约15mL(厚约2.5mm),凝固后加盖,把平皿
倒置,于4℃冷藏保存备用。
8.7.3.2 打孔
反应孔现用现打,从冰箱中取出制备好的琼脂平板,待平板恢复至室温(20 ℃~25 ℃)后,用打孔
器打孔,将孔中的琼脂柱用针头轻轻挑出或用真空泵吸管吸出,勿伤边缘。每个平板可打5 组~
7组孔。
8.7.3.3 加样
用可调移液器加样,见图1加样。“G”孔加抗原,“+”孔加阳性对照血清,其他孔均加被检血清。
每孔均以加满而不溢出为度。然后将琼脂板放入有湿纱布的带盖的湿盒内,置室温中感作。
图1
8.7.3.4 判定
8.7.3.4.1 于24h初判,48h终判,判定时借助观察灯或自然光源。
8.7.3.4.2 当阳性对照血清孔与抗原孔间形成一条清晰、致密沉淀线时,本试验成立,否则需要重新做
试验。
8.7.3.4.3 如果被检血清孔与抗原孔间形成沉淀线,且与阳性对照血清孔和抗原孔间形成的沉淀线末
端相融合,则判为阳性(见图2)。
图2
8.7.3.4.4 如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线形成,但阳性对照血清孔与抗原孔间形成的沉淀线末
端在被检血清孔与抗原孔间向抗原孔侧弯曲,则判为弱阳性,应重复试验,仍为弱阳性者判为阳性(见
图3)。
图3
12
SN/T1088—2024
8.7.3.4.5 如果被检血清孔与抗原孔间形成的沉淀线和阳性对照血清孔与抗原孔之间形成的沉淀线交
叉,则为非特异性沉淀线,应重复试验,仍出现非特异性沉淀线者判为阴性(见图4)。
图4
8.7.3.4.6 如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线出现,阳性对照血清孔与抗原孔形成的沉淀线末端直
伸向被检血清孔,则判为阴性(见图5)。
图5
8.8 全乳环状试验(MPT)
全乳环状试验方法按照GB/T18646执行。
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SN/T1088—2024
附 录 A
(资料性)
疾病概述
布鲁氏菌病又称布氏杆菌病,是一种人畜共患病。家畜中最易感的动物有牛、猪、山羊、绵羊、犬,且对
同种布鲁氏菌最为敏感。牛种布鲁氏菌(Brucellosisabortus)、羊种布鲁氏菌(Brucellosismeligensis)、猪种
布鲁氏菌(Brucellosissuis)对人均有很强的致病性。
牛感染布鲁氏菌通常由牛种布鲁氏菌引起,少数由羊种布鲁氏菌引起,偶尔由猪种布鲁氏菌引起。
山羊和绵羊感染布鲁氏菌主要是由羊种布鲁氏菌引起;绵羊种布鲁氏菌(Brucellaovis)只引起绵羊发
病,目前未见山羊有自然发病的病例;牛种布鲁氏菌也可引起山羊和绵羊发病,但为偶尔发生。猪感染
布鲁氏菌主要由猪种布鲁氏菌引起,由牛种或羊种布鲁氏菌引起猪感染的散发病例也已被观察到,但这
样的病例很少。犬感染布鲁氏菌主要由犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)引起。
布鲁氏菌病的检疫主要以临床症状、流行病学资料和病理变化为初步诊断,确诊主要依据实验室检
测结果。布鲁氏菌病的实验室检测方法包括病原检测和血清学试验。
病原检测有显微镜检查、细菌分离、聚合酶链式反应(PCR)等方法,显微镜检查阳性和阴性结果均
应经细菌培养确证,PCR作为一个补充方法可用于布鲁氏菌鉴定和分型。
血清学试验有虎红平板凝集试验(RBT)、缓冲平板凝集试验(BPAT)、试管凝集试验(SAT)、补体
结合试验(CFT)、间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)、全乳环状试
验(MPT)、荧光偏振试验(FPA)、琼脂扩散试验(AGID)。但没有一种血清学试验适合每种动物和所有
流行病学情况。因而,筛查试验中阳性反应的样品应采用一个确证或补充的方法进行复查。
RBT、BPAT、CFT、EILSA、FPA 适合畜群筛查和小反刍动物、骆驼科和牛科个体检查。I-ELISA、
MPT用于筛查和监测奶牛是有效的试验方法。CFT、AGID 和I-ELISA 适用于绵羊种布鲁氏菌病诊
断,AGID和I-ELISA 的敏感性相当,比CFT更高,CFT是最适用于动物个体的确证试验,因此国际贸
易中CFT仍是指定试验。
在牛种布鲁氏菌监控项目中成功应用SAT许多年,尤其是在北欧。通常认为SAT 不适用于国际
贸易。
对 于其他动物,例如水牛(Bubalusbubalis)、美洲和欧洲野牛(Bisonbison 和Bisonbonasus)、牦牛(Bos
grunniens)、驼鹿/马鹿(Cervuscanadensis)、骆驼(Camelusbactrianus 和Camelusdromedarius)和南美洲骆
驼科,布鲁氏菌感染过程与牛相似,可以用相同的血清学试验程序,但每种试验方法都需进行符合相应动
物品种的验证。
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SN/T1088—2024
附 录 B
(资料性)
临床症状与病理变化
B.1 临床症状
B.1.1 牛感染布鲁氏菌
青年牛和未怀孕母牛感染布鲁氏菌通常无明显临床症状。怀孕母牛感染布鲁氏菌通常导致流
产,流产最常发生在第5~9个月。流产时,可见阴道黏膜发生粟粒大红色结节,由阴道流出灰白色或灰
色黏性分泌液;胎水多清朗,但有时浑浊含有脓样絮片;胎衣可能正常排出,但常见胎衣不下。流产后常
继续排出污灰色或棕红色分泌液,有时恶臭,分泌液1周~2周后消失。早期流产的胎儿,通常在产前
已经死亡。发育比较完全的胎儿,产出时可能存活,但较衰弱,不久死亡。
公牛感染布鲁氏菌常见症状是睾丸炎及附睾炎,可导致不育。
牛感染布鲁氏菌通常也表现腿部关节水囊肿。
B.1.2 猪感染布鲁氏菌
怀孕母猪感染布鲁氏菌最常见的症状也是流产,流产可发生在孕期任何时间,但最常在妊娠的
50d~110d流产。流产前兆症状常见沉郁,阴唇和乳房肿胀,有时阴道流出黏性或黏脓性分泌液。流
产后胎衣不下的情况较少见。母猪不孕也是感染布鲁氏菌的一个症状。
公猪感染布鲁氏菌可出现睾丸、前列腺、附睾、精囊或尿道球腺增生,可发展为肿瘤,生殖器官最终
硬化和萎缩。
猪感染布鲁氏菌在临床上还常见关节肿胀、腱鞘炎、跛行等症状,偶尔出现后肢麻痹或脊椎炎,关节
炎可发生在不同关节。
B.1.3 羊感染布鲁氏菌
山羊感染布鲁氏菌:临床上,母羊主要有流产、胎衣不下,还会表现为乳房炎,尤其是乳山羊的乳房
炎常较早出现。公羊主要表现为睾丸炎、附睾炎。有的病羊还会由于关节炎而出现跛行等症状。
绵羊感染布鲁氏菌:公羊的症状主要表现为生殖器病变(如一侧或偶尔双侧附睾炎)、繁殖力下降。
母羊常发生胎盘炎,怀孕母羊常出现流产和死胎。小羊围产期死亡率增加。
B.1.4 犬感染布鲁氏菌
感染犬种布鲁氏菌的母犬临床症状主要为流产和不孕,一般在40d~50d发生流产,阴唇和阴道
黏膜红肿,阴道内流出淡褐色或灰绿色分泌物,流产后阴道长期排出分泌液,淋巴结肿大,脾炎和长期菌
血症。
公 犬常发生附睾炎、阴囊皮炎、前列腺炎和菌血症,也可导致不育。
B.1.5 其他家畜、圈养野生品种或野生品种感染布鲁氏菌
在单峰骆驼(Camelusdromedarius)、双峰骆驼(C.bactrianus)、大羊驼(Lamaglama)、羊驼(Vicugnapacos)
、原驼(Lamaguanicoe)、骆马(Vicugnavicugna)、家养水牛(Bubalusbubalis)、美洲和欧
洲野牛(Bisonbison 和B.bonasus)、牦牛(Bosgrunniens)、驼鹿/马鹿(Cervuscanadensis)、梅花鹿
(C.nippon)、非洲水牛(Synceruscaffer)和不同羚羊品种中,有感染布鲁氏菌报道。这些动物感染布
15
SN/T1088—2024
鲁氏菌的临床表现与牛、山羊和绵羊的临床症状相似。
B.2 病理变化
猪、羊和牛的剖检病变大致相同。
胎衣呈黄色胶冻样浸润,有些部位覆有纤维蛋白絮片和脓液,有的增厚而杂有出血点。绒毛叶贫血
呈苍黄色,或覆有灰色或黄绿色纤维蛋白絮片,或覆有脂肪状渗出物。
胎儿胃特别是第四胃中有淡黄色或白色黏液絮状物,胃肠和膀胱的浆膜下可能见有点状或线状出
血。浆膜腔有微红色液体,腔壁上可能覆有纤维蛋白凝块,皮下呈出血性浆液性浸润。
脐带常呈浆液性浸润,肥厚。
胎儿和新生犊可能见有肺炎病灶。
淋巴结、脾脏和肝脏有程度不等的肿胀,有的散有炎性坏死灶。
公牛、公猪、公羊的精囊内可能有出血点和坏死灶,睾丸和附睾可能有炎性坏死灶和化脓灶。
犬流产胎儿有皮下水肿、淤血、出血部分组织自溶,母犬子宫内膜发炎。公犬睾丸萎缩以及淋巴结
病变。
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SN/T1088—2024
附 录 C
(规范性)
试剂的配制
C.1 TE缓冲液
10mL1mol/LTris(pH8.0),2mL0.5mol/LNa2EDTA(pH8.0),加水定容至1000mL,分装
后高压灭菌备用。
C.2 10×PCR 缓冲液
200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾。
C.3 电泳缓冲液(TBE)
Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL;使用时10倍
稀释。
C.4 10×加样缓冲液
1% SDS,50%(体积分数)甘油,0.05%溴酚蓝。
17
SN/T1088—2024
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T1088—2024
代替SN/T1088—2010,SN/T2436—2010,SN/T3506—2013
布鲁氏菌病检疫技术规范
Quarantineprotocolforbrucellosis
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语与定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 疾病概述………………………………………………………………………………………………… 1
5 临床症状与病理变化…………………………………………………………………………………… 1
6 生物安全措施…………………………………………………………………………………………… 1
7 病原鉴定………………………………………………………………………………………………… 1
7.1 显微镜检查………………………………………………………………………………………… 1
7.2 细菌培养…………………………………………………………………………………………… 2
7.3 多重聚合酶链式反应(多重PCR)………………………………………………………………… 2
7.4 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)……………………………………………………… 5
8 血清学试验……………………………………………………………………………………………… 8
8.1 虎红平板凝集试验(RBT) ………………………………………………………………………… 8
8.2 缓冲平板凝集试验(BPAT) ……………………………………………………………………… 9
8.3 试管凝集试验(SAT) ……………………………………………………………………………… 9
8.4 补体结合试验(CFT) ……………………………………………………………………………… 9
8.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)……………………………………………………………………… 10
8.6 荧光偏振试验(FPA)……………………………………………………………………………… 10
8.7 琼脂扩散试验(AGID)…………………………………………………………………………… 11
8.8 全乳环状试验(MPT) …………………………………………………………………………… 13
附录A (资料性) 疾病概述……………………………………………………………………………… 14
附录B(资料性) 临床症状与病理变化………………………………………………………………… 15
附录C(规范性) 试剂的配制…………………………………………………………………………… 17
Ⅰ
SN/T1088—2024
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替SN/T1088—2010《布氏杆菌检疫技术规范》、SN/T2436—2010《山羊和绵羊布鲁氏菌病
检疫规程》、SN/T3506—2013《布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程》,与SN/T1088—2010、SN/T2436—
2010、SN/T3506—2013相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
———删除了聚合酶链反应(见SN/T1088—2010的5.3);
———增加了多重聚合酶链式反应(见7.3);
———增加了实时荧光聚合酶链式反应(见7.4);
———增加了试管凝集试验微量法(见8.3.2)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国天津海关。
本文件主要起草人:王玉玲、王建华、张俊哲、刘誉、马鑫淼、赵丹、陈本龙、柴铭骏、王乃福、陈小金、
刘培、刘洋。
本文件所代替文件的历次版本发布情况为:
———SN/T1088,2002年首次发布,2010年第一次修订,修订时并入了SN/T1089—2002《布氏杆
菌病补体结合试验操作规程》、SN/T1090—2002《布氏杆菌病试管凝集试验操作规程》、
SN/T1394—2004《布氏杆菌病全乳环状试验方法》、SN/T1525—2005《布氏杆菌病微量补体
结合试验方法》;
———SN/T2436,2010年首次发布;
———SN/T3506,2013年首次发布。
Ⅲ
SN/T1088—2024
布鲁氏菌病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了布鲁氏菌病的显微镜检查、细菌培养、多重聚合酶链式反应(多重PCR)、实时荧光聚
合酶链式反应(实时荧光PCR)、虎红平板凝集试验、缓冲平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、
酶联免疫吸附试验、荧光偏振试验、琼脂扩散试验、全乳环状试验等诊断技术。
本文件适用于布鲁氏菌病的临床诊断和实验室检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18646 动物布鲁氏菌病诊断技术
GB19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 疾病概述
见附录A。
5 临床症状与病理变化
见附录B。
6 生物安全措施
为了保护实验室人员和环境的安全,应由具备资格的工作人员进行布鲁氏菌病原鉴定和血清学检
验,应采取预防气溶胶感染的安全防护措施。所有培养物和废弃物应经高压灭菌后处置。病原分离培
养工作应在生物安全三级实验室中进行。生物安全措施应按照GB19489中的有关规定执行。
7 病原鉴定
7.1 显微镜检查
显微镜检查方法按GB/T18646执行。
1
SN/T1088—2024
7.2 细菌培养
细菌培养方法按GB/T18646执行。
7.3 多重聚合酶链式反应(多重PCR)
7.3.1 仪器和设备
高速低温离心机、手掌式台式离心机、PCR扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像分析仪、水浴锅、漩涡振
荡器、可调移液器。
7.3.2 试剂和材料
7.3.2.1 细菌基因组DNA 提取试剂盒。
7.3.2.2 布鲁氏菌质控菌株:猪种布鲁氏菌标准菌株或其模板DNA。
7.3.2.3 10×Taqbuffer、dNTP混合液(2.5mmol/L,含镁离子)、Taq HS聚合酶(250U,5U/μL)或
其他适合的商品化的PCR试剂,5kbDNA 分子质量标准(5kbDNA marker)。
7.3.2.4 TE缓冲液、1×电泳缓冲液(1×TBE)、GelRed或其他适合的商品化的安全无毒核酸凝胶染色
试剂、10×加样缓冲液或其他适合的商品化加样缓冲液,按附录C配制。
7.3.2.5 琼脂糖。
7.3.2.6 试验用双蒸水(ddH2O):符合GB/T6682中的二级水。
7.3.2.7 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。
7.3.2.8 PCR反应管。
7.3.3 操作步骤
7.3.3.1 样品制备
7.3.3.1.1 标准菌株:用无菌接种环挑取单个布鲁氏菌质控菌株菌落,放入200μL无菌双蒸水。
7.3.3.1.2 样品:可疑布鲁氏菌培养物,用接种环挑取单个可疑菌落于200μL无菌双蒸水。
7.3.3.2 DNA 模板的提取
将7.3.3.1制备的菌悬液80 ℃灭活2h,按适合的基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取模板
DNA,然后12000r/min离心20s,取上清液作为PCR 扩增时模板DNA(DNA 浓度为0.1μg/μL~
0.05μg/μL)。
7.3.3.3 引物
PCR引物序列见表1。
表1 PCR 引物序列
序号引物序列5'→3' 扩增片段大小/bp
1 BMEI0998—F ATC-CTA-TTG-CCC-CGA-TAA-GG 1682(2524a)
BMEI0997—R GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT-AGC
2 BMEI0535—F GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATG-AA 450(1320b)
BMEI0536—R CGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CTA-TAA
2
SN/T1088—2024
表1 PCR 引物序列(续)
序号引物序列5'→3' 扩增片段大小/bp
3 BMEII0843—F TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAG-CA 1071
BMEII0844—R GCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TGA-TG
4 BMEI1426—F TCG-TCG-GTG-GAC-TGG-ATG-AC 774
BMEI1427—R ATG-GTC-CGC-AAG-GTG-CTT-TT
5 BMEII0428—F GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACT-GG 587
BMEII0428—R AAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-CG
6 BR0953—F GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTT-GT 272
BR0953—R GAT-GGA-GCA-AAC-GCT-GAA-G
7 BMEI0752—F CAG-GCA-AAC-CCT-CAG-AAG-C 218
BMEI0752—R GAT-GTG-GTA-ACG-CAC-ACC-AA
8 BMEII0987—F CGC-AGA-CAG-TGA-CCA-TCA-AA 152
BMEII0987—R GTA-TTC-AGC-CCC-CGT-TAC-CT
9 BMISPEC—F AGA-TAC-TGG-AAC-ATA-GCC-CG 510
BMISPEC—R ATA-CTC-AGG-CAG-GAT-ACC-GC
a 扩增牛种布鲁氏菌疫苗株RB51时片段大小为2524bp。
b 扩增海洋种时片段大小为1320bp。
7.3.3.4 反应体系
PCR反应体系见表2。
表2 PCR 反应体系
成分体积
10×PCRBuffer 2.5μL
2.5mmol/LdNTP混合液(含镁离子) 2.0μL
引物混合液[5μmol/(L·条)] 2.5μL
ddH2O 16.75μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25μL
模板DNA 1.0μL
注:引物混合液[5μmol/(L·条)]指每条引物在混合液中的浓度为5μmol/L,9对引物先配制成混合液再加入
体系中。
PCR反应管中依次加入上述成分,充分混匀后,瞬时离心。反应总体积为25μL。
同时设立阳性对照、阴性对照,用猪种布鲁氏菌标准菌株的模板DNA 作阳性对照,用无菌水作阴
性对照。
循环条件:95℃预变性7min,94℃变性30s,58℃退火90s,72℃延伸3min,共30个循环,72℃
延伸6min,4℃下保存。
3
SN/T1088—2024
7.3.3.5 PCR 扩增产物电泳检测
取1.5g琼脂糖,加入100mL电泳缓冲液加热溶解,加入GelRed或其他适合的安全无毒核酸凝胶
染色试剂终浓度为1×,制胶,将7μL的Marker和PCR 扩增产物分别与适量的加样缓冲液混合,点
样。120V,电泳60min左右,凝胶成像分析系统检测并记录结果。
7.3.3.6 结果判定
当阳性对照在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带,阴性对照不
出现条带时,试验成立,可进行被检样品的判定。表3对判定结果进行了归纳。
a) 被检样品在1682bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为牛种布鲁氏菌
(B.abortus);
b) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为羊种布
鲁氏菌(B.melitensis);
c) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带时,判定为
猪种布鲁氏菌(B.suis);
d) 被检样品在1682bp、1071bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带时,判定为犬种布
鲁氏菌(B.canis);
e) 被检样品在1071bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为绵羊种布鲁氏菌
(B.ovis);
f) 被检样品在2524bp、774bp、587bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为牛种布鲁氏菌疫苗
株RB51(vaccinestrainB.abortus RB51);
g) 被检样品在1682bp、774bp、450bp、152bp处出现条带时,判定为牛种布鲁氏菌疫苗株S19
(vaccinestrainB.abortusS19);
h) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、218bp、152bp处出现条带时,判定为
羊种布鲁氏菌疫苗株Rev1(vaccinestrainB.melitensis Rev1);
i) 被检样品在1682bp、1320bp、1071bp、774bp、587bp、152bp处出现条带时,判定为海洋哺
乳动物种布鲁氏菌(Brucellaisolatedfrom marinemammal);
j) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、450bp、272bp处出现条带时,判定为沙林鼠
种布鲁氏菌(B.neotomae)。
k) 被检样品在1682bp、1071bp、774bp、587bp、510bp、450bp、272bp、152bp处出现条带
时,判定为田鼠种布鲁氏菌(B.microti)。
l) 被检样品在1682bp、774bp、587bp、450bp、272bp、152bp处出现条带时,判定为人种布鲁
氏菌(B.inopinata)。
表3 结果判定
布鲁氏菌种
扩增片段大小/bp
152 218 272 450 510 587 774 1071 1320 1682 2524
条带
数量
牛种+ - - + - + + - - + - 5
羊种+ - - + - + + + - + - 6
猪种+ - + + - + + + - + - 7
犬种+ - + + - + - + - + - 6
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表3 结果判定(续)
布鲁氏菌种
扩增片段大小/bp
152 218 272 450 510 587 774 1071 1320 1682 2524
条带
数量
绵羊种+ - - + - + + + - - - 5
RB51疫苗株+ - - + - + + - - - + 5
S19疫苗株+ - - + - - + - - + - 4
Rev1疫苗株+ + - + - + + + - + - 7
海洋种
哺乳动物+ - - - - + + + + + - 6
沙林鼠种- - + + - + + + - + - 6
田鼠种+ - + + + + + + - + - 8
人种+ - + + - + + - - + - 6
注:“+”为出现条带,“-”为未出现条带。
7.4 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)
7.4.1 通用型荧光PCR
7.4.1.1 仪器和设备
高速低温离心机、普通台式离心机、荧光PCR仪、水浴锅、漩涡振荡器、可调移液器。
7.4.1.2 试剂和材料
7.4.1.2.1 细菌基因组DNA 提取试剂盒或组织和全血基因组DNA 提取试剂盒或用于奶样基因组
DNA 提取试剂盒。
7.4.1.2.2 猪种布鲁氏菌标准菌株或其模板DNA。
7.4.1.2.3 反应液:PremixExTaq(probeqPCR)浓度2×或其他适合的商品化荧光PCR反应液。
7.4.1.2.4 试验用水(H2O):无核酸酶水或符合GB/T6682中的三级水。
7.4.1.2.5 荧光PCR反应管。
7.4.1.2.6 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。
7.4.1.3 操作步骤
7.4.1.3.1 样品制备
见7.3.3.1。
7.4.1.3.2 DNA 模板的提取
将7.3.3.1制备的菌悬液或增菌液或阴道分泌物、全血、奶液、子宫或脾组织均质液等检疫样品
80℃灭活2h,按适合的基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取DNA,12000r/min离心20s,取上
清液作为荧光PCR反应模板DNA。
7.4.1.3.3 引物和探针序列
上游引物(IS117-F1):5'-CGCTCGCGCGGTGGAT-3'。
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SN/T1088—2024
下游引物(IS117-R1):5'-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3'。
探针(IS117-P1):FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-BHQ1。
7.4.1.3.4 反应体系
通用型荧光PCR反应体系见表4。
表4 通用型荧光PCR 反应体系
成分体积
2×PremixExTaq(probeqPCR) 12.5μL
2.5μmol/L探针2.0μL
10μmol/L上游引物0.75μL
10μmol/L下游引物0.75μL
H2O 8.0μL
模板DNA 1.0μL
注:菌悬液样品提取的模板DNA用量1.0μL;检疫样品提取的模板DNA用量9.0μL。
反应管中依次加上述成分于管底,封严管口。反应总体积为25μL。
同时设立阳性对照、阴性对照,用猪种布鲁氏菌标准菌株的模板DNA 作阳性对照,用无菌水作阴
性对照。
反应参数:95℃预变性10min,95℃15s,60℃60s,45个循环。
7.4.1.3.5 结果判定
7.4.1.3.5.1 结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点,不同仪器
可根据仪器噪声情况进行调整。
7.4.1.3.5.2 质控标准
阴性对照应无Ct值或Ct值>40.0;阳性对照的Ct值应<40.0,并出现典型的扩增曲线。否则,此
次试验视为无效,需重复试验。
7.4.1.3.5.3 结果描述及判定
无Ct值并且无扩增曲线或Ct值>40.0,表示样品中无布鲁氏菌,判定为阴性。
Ct值<38.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在布鲁氏菌,判定为阳性。
38.0≤Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中可能存在布鲁氏菌,需重复试验。重复试
验结果仍为38.0≤Ct值≤40.0,或者Ct值<38.0,判定为阳性,否则,判定为阴性。
7.4.2 鉴别型荧光PCR
7.4.2.1 仪器和设备
高速低温离心机、普通台式离心机、荧光PCR仪、水浴锅、漩涡振荡器、可调移液器。
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SN/T1088—2024
7.4.2.2 试剂和材料
7.4.2.2.1 细菌基因组DNA 提取试剂盒或组织和全血基因组DNA 提取试剂盒或用于奶样基因组
DNA 提取试剂盒。
7.4.2.2.2 猪种布鲁氏菌标准菌株或模板DNA。
7.4.2.2.3 反应液:PremixExTaq(probeqPCR)浓度2×或其他适合的商品化的荧光PCR反应液。
7.4.2.2.4 试验用水(H2O):无核酸酶水或符合GB/T6682中的三级水。
7.4.2.2.5 荧光PCR反应管。
7.4.2.2.6 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。
7.4.2.3 操作步骤
7.4.2.3.1 样品制备
见7.3.3.1。
7.4.2.3.2 DNA 模板的提取
将7.3.3.1制备的菌悬液或增菌液或阴道分泌物、全血、奶液、子宫或脾组织均质液等检疫样品80℃灭
活2h,按适合的基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取DNA,12000r/min离心20s,取上清液作为
荧光PCR反应模板DNA。
7.4.2.3.3 引物和探针序列
引物和探针序列见表5。
表5 引物和探针序列
序号菌种引物引物序列5'→3' 探针序列5'→3'
1 羊种BMEII0466—F TCGCATCGGCAGTTTCAA FAM-CCTCGGCATGGCCCGCAA-BHQ-1
BMEII0466—R CCAGCTTTTGGCCTTTTCC
2 牛种BruAb2_0168—F GCACACTCACCTTCCACAACAA FAM-TGGAACGACCTTTGCAGGCGAG
ATC-BHQ1
BruAb2_0168—R CCCCGTTCTGCACCAGACT
3 猪种BR0952—F CCTGCAAAAAGCAGGAACCA FAM-ATATGGCCGGCTATCCGCGTTCG -
BHQ1
BR0952—R CCTCCGCCAGTCGTGAAA
4 绵羊种BOV_A0504—F CGCTATCGATGGCGTAGTTG FAM-TGGCCTGACGGACGCGCTTATCBHQ-
1
BOV_A0504—R CCCTGATTTCAAGCCATTCC
5 犬种BMEII0635-0636—F AAAATGCGGATCGGCCTT FAM-CCACGGCTTTCGCTCGGGC-BHQ1
BMEII0635-0636—R TCCCGGCGCATTGCT
7.4.2.3.4 反应体系
鉴别型荧光PCR反应体系见表6。
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SN/T1088—2024
表6 鉴别型荧光PCR 反应体系
成分体积
2×PremixExTaq(probeqPCR) 12.5μL
2.5μmol/L探针2.0μL
10μmol/L上游引物0.75μL
10μmol/L下游引物0.75μL
H2O 8.0μL
模板DNA 1.0μL
注:菌悬液样品提取的模板DNA用量1.0μL;检疫样品提取的模板DNA用量9.0μL。
反应管中依次加上述成分于管底,封严管口。反应总体积为25μL。
依据样品检测目标物数量,选取若干个反应管。检测羊种布鲁氏菌时在管中加入序号1引物和探
针,检测牛种布鲁氏菌时在管中加入序号2引物和探针,检测猪种布鲁氏菌时在管中加入序号3引物和
探针,检测绵羊种布鲁氏菌时在管中加入序号4引物和探针,检测犬种布鲁氏菌时在管中加入序号5引
物和探针。
同时设立阳性对照、阴性对照,用猪种布鲁氏菌标准菌株的模板DNA 作阳性对照,用无菌水作阴
性对照。
反应参数:95℃预变性10min,95℃15s,60℃60s,45个循环。
7.4.2.3.5 结果判定
7.4.2.3.5.1 结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点,不同仪器
可根据仪器噪声情况进行调整。
7.4.2.3.5.2 质控标准
阴性对照应无Ct值或Ct值>40.0;阳性对照的Ct值应<40.0,并出现典型的扩增曲线。否则,此
次试验视为无效,需重复试验。
7.4.2.3.5.3 结果描述及判定
无Ct值并且无扩增曲线或Ct值>40.0,表示样品中无相应种的布鲁氏菌。
Ct值<38.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在相应种的布鲁氏菌。
38.0≤Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中可能存在相应种的布鲁氏菌,需重复试验。
重复试验结果仍为38.0≤Ct值≤40.0,或Ct值<38.0,表示样品中存在相应种的布鲁氏菌,否则,表示
样品中无相应种的布鲁氏菌。
8 血清学试验
8.1 虎红平板凝集试验(RBT)
虎红平板凝集试验方法按照GB/T18646执行。
8
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8.2 缓冲平板凝集试验(BPAT)
8.2.1 仪器和设备
可调微量移液器。
8.2.2 试剂和材料
8.2.2.1 抗原:按说明书使用。
8.2.2.2 阳性对照血清、阴性对照血清:均为冻干品,使用前按说明用蒸馏水溶解至规定容积。
8.2.2.3 玻璃板:约45cm×30cm,要求洁净,划成32个方格,横数8个格,纵数4个格,每格4cm×
4cm,每一格下再划1cm 宽的小格,用于填写血清号。
8.2.2.4 洁净的玻璃小棒或塑料小棒或灭菌扁形圆头牙签。
8.2.2.5 移液器滴头:200μL。
8.2.3 操作步骤
8.2.3.1 试验前将抗原和血清置室温(22±4)℃30min~60min。
8.2.3.2 将玻璃板上各格标上被检血清号,然后加入相应的被检血清80μL。同时作阳性血清和阴性
血清对照,对照血清的加样量同被检血清。
8.2.3.3 将缓冲平板凝集抗原轻轻充分摇匀,在被检血清旁加30μL。
8.2.3.4 用小棒或牙签混匀被检血清和抗原,使之形成直径约3cm 的圆形或椭圆形液区。
8.2.3.5 将玻璃板旋转3次,以使血清与抗原均匀散开。室温(22±4)℃下湿盒内孵育4min。
8.2.3.6 取出反应板,重复8.2.3.5。
8.2.3.7 取出板,边旋转边观察凝集情况。
8.2.3.8 每次操作以不超过20份血清样品为宜,以免样品干燥而不易观察结果。
8.2.3.9 结果判定:当阴性血清对照不出现凝集(-),阳性血清对照出现凝集(+)时,则试验成立,可以
判定,否则试验应重做。出现肉眼可见凝集现象(出现凝块或颗粒物)者判为阳性(+),不出现凝集者判
为阴性(-)。
8.3 试管凝集试验(SAT)
8.3.1 常量法
按照GB/T18646执行。
8.3.2 微量法
按照GB/T18646执行。
8.4 补体结合试验(CFT)
8.4.1 常量法
按照GB/T18646执行。
8.4.2 微量法
按照GB/T18646执行。
9
SN/T1088—2024
8.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)
8.5.1 间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)
按照GB/T18646执行。使用商品化I-ELISA 抗体检测试剂盒时,按相应说明书使用。
8.5.2 竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)
按照GB/T18646执行。使用商品化C-ELISA 抗体检测试剂盒时,按相应说明书使用。
8.6 荧光偏振试验(FPA)
8.6.1 原理
溶液中的分子做随机转动。分子的大小是影响转动速率的主要因素,与其成反比关系,也就是小分
子比大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素,通过68.5°角度的转动时间即可通过测量水平和垂
直的偏振光强度来确定。因而,大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。当样品中有目标抗体
时,加入标记荧光素的抗原后,与其发生抗原抗体结合而降低了分子的转动速度,通过测量偏振光的强
度判定样品的阴性、阳性。
8.6.2 仪器和设备
荧光偏振分析仪、可调微量移液器、平板振荡器。
8.6.3 试剂和材料
8.6.3.1 阳性对照:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.2 阴性对照:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.3 25×浓缩的反应缓冲液:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.4 结合物:标记有异硫氰荧光素的O 型多糖(OPS)抗原,布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。
8.6.3.5 试验用水:符合GB/T6682中的三级水。
8.6.3.6 微量板:96孔,黑色平底。
8.6.3.7 微量移液器滴头:200μL。
8.6.4 操作步骤
8.6.4.1 将试剂和样品恢复至室温(18℃~26℃)。
8.6.4.2 将25×浓缩反应缓冲液用蒸馏水做1∶25稀释,制备稀释的反应缓冲液避免有颗粒物,稀释
后的缓冲液放置常温保存,并在1个月内使用。
8.6.4.3 被检血清样品中应避免含有颗粒物,如出现颗粒物应做离心处理。
8.6.4.4 取20μL阴性对照加入微量板A1、B1、C1孔中。
8.6.4.5 取20μL阳性对照加入微量板D1孔中。
8.6.4.6 取20μL血清样品加入微量板其余相应孔中。在向微量板加样或加液体时应避免气泡产生。
8.6.4.7 取180μL稀释的反应缓冲液加入微量板的每个反应孔中,置振荡器上中速振荡2min。
8.6.4.8 将反应板置室温(18℃~26℃)孵育3min~5min后,置荧光偏振仪(激发波长485nm,发射
波长528nm)上读取缓冲液和样品的初始值,作为空白偏振值。
8.6.4.9 取10μL结合物加入每个反应孔中,置振荡器上中速振荡2min。
8.6.4.10 将反应板置室温(18℃~26℃)孵育2min~3min,置荧光偏振仪上读取最终偏振值。
8.6.4.11 结果判定:对照或样品的偏振值计算见式(1)。
10
SN/T1088—2024
FP =A -B …………………………(1)
式中:
FP ———对照或样品的偏振值,单位为毫偏振(mP);
A ———对照或样品的最终偏振值,单位为毫偏振(mP);
B ———对照或样品的初始偏振值,单位为毫偏振(mP)。
当阳性对照的偏振值为120mP~250mP,阴性对照的偏振值为70mP~95mP时,方可进行被检
样品的结果判定。若阳性对照或阴性对照的偏振值超出规定的范围,需要根据仪器手册的说明重新校
正仪器。
结果判定计算见式(2)。
Δ =FP -C …………………………(2)
式中:
Δ ———样品的偏振值与阴性对照平均偏振值的差值,单位为毫偏振(mP);
FP———对照或样品的偏振值,单位为毫偏振(mP);
C ———阴性对照的平均偏振值,单位为毫偏振(mP)。
被检样品为牛血清时,Δ<10mP,样品判为阴性;10mP≤Δ≤20mP,样品判为可疑;Δ>20mP,样品
判为阳性。
被检样品为羊血清时,Δ<10mP,样品判为阴性;10mP≤Δ≤15mP,样品判为可疑;Δ>15mP,样品
判为阳性。
被检样品为猪血清时,Δ<10mP,样品判为阴性;10mP≤Δ≤20mP,样品判为可疑;Δ>20mP,样品
判为阳性。
可疑样品应双份重复试验。若两次样品的Δ 均小于10mP,判为阴性;若有一次样品的Δ 在可疑
值范围内或大于阳性值范围,判为可疑,应采用其他试验进行确证;若两次样品的Δ 均大于阳性值范
围,判为阳性。
8.7 琼脂扩散试验(AGID)
8.7.1 仪器和设备
水浴锅、可调微量移液器。
8.7.2 试剂和材料
8.7.2.1 琼脂糖:分析纯。
8.7.2.2 氯化钠:分析纯。
8.7.2.3 硼酸盐缓冲液:硼酸12.4g(分析纯)、氯化钾14.5g、蒸馏水1600mL,用0.2mol/L氢氧化钠
调pH 至8.3±0.02,最后补加蒸馏水至2000mL。
8.7.2.4 阳性对照血清。
8.7.2.5 抗原。
8.7.2.6 平皿:规格90mm×15mm,一次性平皿或洁净灭菌的玻璃平皿。
8.7.2.7 七孔打孔器:孔径3mm,孔距3mm。
8.7.2.8 移液器滴头:200μL。
8.7.3 操作步骤
8.7.3.1 琼脂平板的制备
分别取琼脂糖1g、氯化钠10g、硼酸盐缓冲液100mL,加入三角瓶中,在水浴中充分煮沸溶解,冷
11
SN/T1088—2024
却至56℃左右,将平皿置于水平台上,在每个平皿中加入约15mL(厚约2.5mm),凝固后加盖,把平皿
倒置,于4℃冷藏保存备用。
8.7.3.2 打孔
反应孔现用现打,从冰箱中取出制备好的琼脂平板,待平板恢复至室温(20 ℃~25 ℃)后,用打孔
器打孔,将孔中的琼脂柱用针头轻轻挑出或用真空泵吸管吸出,勿伤边缘。每个平板可打5 组~
7组孔。
8.7.3.3 加样
用可调移液器加样,见图1加样。“G”孔加抗原,“+”孔加阳性对照血清,其他孔均加被检血清。
每孔均以加满而不溢出为度。然后将琼脂板放入有湿纱布的带盖的湿盒内,置室温中感作。
图1
8.7.3.4 判定
8.7.3.4.1 于24h初判,48h终判,判定时借助观察灯或自然光源。
8.7.3.4.2 当阳性对照血清孔与抗原孔间形成一条清晰、致密沉淀线时,本试验成立,否则需要重新做
试验。
8.7.3.4.3 如果被检血清孔与抗原孔间形成沉淀线,且与阳性对照血清孔和抗原孔间形成的沉淀线末
端相融合,则判为阳性(见图2)。
图2
8.7.3.4.4 如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线形成,但阳性对照血清孔与抗原孔间形成的沉淀线末
端在被检血清孔与抗原孔间向抗原孔侧弯曲,则判为弱阳性,应重复试验,仍为弱阳性者判为阳性(见
图3)。
图3
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8.7.3.4.5 如果被检血清孔与抗原孔间形成的沉淀线和阳性对照血清孔与抗原孔之间形成的沉淀线交
叉,则为非特异性沉淀线,应重复试验,仍出现非特异性沉淀线者判为阴性(见图4)。
图4
8.7.3.4.6 如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线出现,阳性对照血清孔与抗原孔形成的沉淀线末端直
伸向被检血清孔,则判为阴性(见图5)。
图5
8.8 全乳环状试验(MPT)
全乳环状试验方法按照GB/T18646执行。
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附 录 A
(资料性)
疾病概述
布鲁氏菌病又称布氏杆菌病,是一种人畜共患病。家畜中最易感的动物有牛、猪、山羊、绵羊、犬,且对
同种布鲁氏菌最为敏感。牛种布鲁氏菌(Brucellosisabortus)、羊种布鲁氏菌(Brucellosismeligensis)、猪种
布鲁氏菌(Brucellosissuis)对人均有很强的致病性。
牛感染布鲁氏菌通常由牛种布鲁氏菌引起,少数由羊种布鲁氏菌引起,偶尔由猪种布鲁氏菌引起。
山羊和绵羊感染布鲁氏菌主要是由羊种布鲁氏菌引起;绵羊种布鲁氏菌(Brucellaovis)只引起绵羊发
病,目前未见山羊有自然发病的病例;牛种布鲁氏菌也可引起山羊和绵羊发病,但为偶尔发生。猪感染
布鲁氏菌主要由猪种布鲁氏菌引起,由牛种或羊种布鲁氏菌引起猪感染的散发病例也已被观察到,但这
样的病例很少。犬感染布鲁氏菌主要由犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)引起。
布鲁氏菌病的检疫主要以临床症状、流行病学资料和病理变化为初步诊断,确诊主要依据实验室检
测结果。布鲁氏菌病的实验室检测方法包括病原检测和血清学试验。
病原检测有显微镜检查、细菌分离、聚合酶链式反应(PCR)等方法,显微镜检查阳性和阴性结果均
应经细菌培养确证,PCR作为一个补充方法可用于布鲁氏菌鉴定和分型。
血清学试验有虎红平板凝集试验(RBT)、缓冲平板凝集试验(BPAT)、试管凝集试验(SAT)、补体
结合试验(CFT)、间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)、全乳环状试
验(MPT)、荧光偏振试验(FPA)、琼脂扩散试验(AGID)。但没有一种血清学试验适合每种动物和所有
流行病学情况。因而,筛查试验中阳性反应的样品应采用一个确证或补充的方法进行复查。
RBT、BPAT、CFT、EILSA、FPA 适合畜群筛查和小反刍动物、骆驼科和牛科个体检查。I-ELISA、
MPT用于筛查和监测奶牛是有效的试验方法。CFT、AGID 和I-ELISA 适用于绵羊种布鲁氏菌病诊
断,AGID和I-ELISA 的敏感性相当,比CFT更高,CFT是最适用于动物个体的确证试验,因此国际贸
易中CFT仍是指定试验。
在牛种布鲁氏菌监控项目中成功应用SAT许多年,尤其是在北欧。通常认为SAT 不适用于国际
贸易。
对 于其他动物,例如水牛(Bubalusbubalis)、美洲和欧洲野牛(Bisonbison 和Bisonbonasus)、牦牛(Bos
grunniens)、驼鹿/马鹿(Cervuscanadensis)、骆驼(Camelusbactrianus 和Camelusdromedarius)和南美洲骆
驼科,布鲁氏菌感染过程与牛相似,可以用相同的血清学试验程序,但每种试验方法都需进行符合相应动
物品种的验证。
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附 录 B
(资料性)
临床症状与病理变化
B.1 临床症状
B.1.1 牛感染布鲁氏菌
青年牛和未怀孕母牛感染布鲁氏菌通常无明显临床症状。怀孕母牛感染布鲁氏菌通常导致流
产,流产最常发生在第5~9个月。流产时,可见阴道黏膜发生粟粒大红色结节,由阴道流出灰白色或灰
色黏性分泌液;胎水多清朗,但有时浑浊含有脓样絮片;胎衣可能正常排出,但常见胎衣不下。流产后常
继续排出污灰色或棕红色分泌液,有时恶臭,分泌液1周~2周后消失。早期流产的胎儿,通常在产前
已经死亡。发育比较完全的胎儿,产出时可能存活,但较衰弱,不久死亡。
公牛感染布鲁氏菌常见症状是睾丸炎及附睾炎,可导致不育。
牛感染布鲁氏菌通常也表现腿部关节水囊肿。
B.1.2 猪感染布鲁氏菌
怀孕母猪感染布鲁氏菌最常见的症状也是流产,流产可发生在孕期任何时间,但最常在妊娠的
50d~110d流产。流产前兆症状常见沉郁,阴唇和乳房肿胀,有时阴道流出黏性或黏脓性分泌液。流
产后胎衣不下的情况较少见。母猪不孕也是感染布鲁氏菌的一个症状。
公猪感染布鲁氏菌可出现睾丸、前列腺、附睾、精囊或尿道球腺增生,可发展为肿瘤,生殖器官最终
硬化和萎缩。
猪感染布鲁氏菌在临床上还常见关节肿胀、腱鞘炎、跛行等症状,偶尔出现后肢麻痹或脊椎炎,关节
炎可发生在不同关节。
B.1.3 羊感染布鲁氏菌
山羊感染布鲁氏菌:临床上,母羊主要有流产、胎衣不下,还会表现为乳房炎,尤其是乳山羊的乳房
炎常较早出现。公羊主要表现为睾丸炎、附睾炎。有的病羊还会由于关节炎而出现跛行等症状。
绵羊感染布鲁氏菌:公羊的症状主要表现为生殖器病变(如一侧或偶尔双侧附睾炎)、繁殖力下降。
母羊常发生胎盘炎,怀孕母羊常出现流产和死胎。小羊围产期死亡率增加。
B.1.4 犬感染布鲁氏菌
感染犬种布鲁氏菌的母犬临床症状主要为流产和不孕,一般在40d~50d发生流产,阴唇和阴道
黏膜红肿,阴道内流出淡褐色或灰绿色分泌物,流产后阴道长期排出分泌液,淋巴结肿大,脾炎和长期菌
血症。
公 犬常发生附睾炎、阴囊皮炎、前列腺炎和菌血症,也可导致不育。
B.1.5 其他家畜、圈养野生品种或野生品种感染布鲁氏菌
在单峰骆驼(Camelusdromedarius)、双峰骆驼(C.bactrianus)、大羊驼(Lamaglama)、羊驼(Vicugnapacos)
、原驼(Lamaguanicoe)、骆马(Vicugnavicugna)、家养水牛(Bubalusbubalis)、美洲和欧
洲野牛(Bisonbison 和B.bonasus)、牦牛(Bosgrunniens)、驼鹿/马鹿(Cervuscanadensis)、梅花鹿
(C.nippon)、非洲水牛(Synceruscaffer)和不同羚羊品种中,有感染布鲁氏菌报道。这些动物感染布
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鲁氏菌的临床表现与牛、山羊和绵羊的临床症状相似。
B.2 病理变化
猪、羊和牛的剖检病变大致相同。
胎衣呈黄色胶冻样浸润,有些部位覆有纤维蛋白絮片和脓液,有的增厚而杂有出血点。绒毛叶贫血
呈苍黄色,或覆有灰色或黄绿色纤维蛋白絮片,或覆有脂肪状渗出物。
胎儿胃特别是第四胃中有淡黄色或白色黏液絮状物,胃肠和膀胱的浆膜下可能见有点状或线状出
血。浆膜腔有微红色液体,腔壁上可能覆有纤维蛋白凝块,皮下呈出血性浆液性浸润。
脐带常呈浆液性浸润,肥厚。
胎儿和新生犊可能见有肺炎病灶。
淋巴结、脾脏和肝脏有程度不等的肿胀,有的散有炎性坏死灶。
公牛、公猪、公羊的精囊内可能有出血点和坏死灶,睾丸和附睾可能有炎性坏死灶和化脓灶。
犬流产胎儿有皮下水肿、淤血、出血部分组织自溶,母犬子宫内膜发炎。公犬睾丸萎缩以及淋巴结
病变。
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附 录 C
(规范性)
试剂的配制
C.1 TE缓冲液
10mL1mol/LTris(pH8.0),2mL0.5mol/LNa2EDTA(pH8.0),加水定容至1000mL,分装
后高压灭菌备用。
C.2 10×PCR 缓冲液
200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾。
C.3 电泳缓冲液(TBE)
Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL;使用时10倍
稀释。
C.4 10×加样缓冲液
1% SDS,50%(体积分数)甘油,0.05%溴酚蓝。
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