SN/T 1559-2024 非洲猪瘟检疫技术规范

ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T1559—2024
代替SN/T1559—2010
非洲猪瘟检疫技术规范
QuarantineprotocolforAfricanswinefever
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 缩略语…………………………………………………………………………………………………… 1
5 实验室生物安全要求…………………………………………………………………………………… 2
6 样品采集及制备………………………………………………………………………………………… 2
6.1 主要试剂…………………………………………………………………………………………… 2
6.2 样品采集…………………………………………………………………………………………… 2
6.3 样品制备…………………………………………………………………………………………… 3
7 病毒红细胞吸附试验(HAD)…………………………………………………………………………… 3
7.1 概述………………………………………………………………………………………………… 3
7.2 仪器设备…………………………………………………………………………………………… 3
7.3 试验材料…………………………………………………………………………………………… 3
7.4 试验程序…………………………………………………………………………………………… 3
7.5 结果判定…………………………………………………………………………………………… 4
8 病毒荧光抗体试验(FAT)……………………………………………………………………………… 4
8.1 概述………………………………………………………………………………………………… 4
8.2 仪器设备…………………………………………………………………………………………… 4
8.3 试验材料…………………………………………………………………………………………… 5
8.4 试验程序…………………………………………………………………………………………… 5
8.5 结果判定…………………………………………………………………………………………… 5
9 聚合酶链式反应(PCR)………………………………………………………………………………… 5
9.1 概述………………………………………………………………………………………………… 5
9.2 仪器设备…………………………………………………………………………………………… 6
9.3 主要试剂…………………………………………………………………………………………… 6
9.4 核酸提取…………………………………………………………………………………………… 6
9.5 试验程序…………………………………………………………………………………………… 6
9.6 结果判定…………………………………………………………………………………………… 7
10 Taqman探针荧光PCR试验………………………………………………………………………… 7
10.1 概述………………………………………………………………………………………………… 7
10.2 仪器设备…………………………………………………………………………………………… 7
10.3 主要试剂7 ……………………………………………………………………………………………Ⅰ
SN/T1559—2024
10.4 核酸提取…………………………………………………………………………………………… 7
10.5 试验程序…………………………………………………………………………………………… 7
10.6 结果判定…………………………………………………………………………………………… 8
11 重组酶介导的等温核酸扩增试验(荧光RAA试验)………………………………………………… 8
12 环介导等温扩增反应(LAMP试验) ………………………………………………………………… 9
12.1 仪器设备…………………………………………………………………………………………… 9
12.2 主要试剂…………………………………………………………………………………………… 9
12.3 核酸提取…………………………………………………………………………………………… 9
12.4 试验程序…………………………………………………………………………………………… 9
12.5 结果判定………………………………………………………………………………………… 10
13 间接ELISA抗体试验………………………………………………………………………………… 10
14 阻断ELISA抗体试验………………………………………………………………………………… 10
15 免疫过氧化物酶试验(IPT) ………………………………………………………………………… 10
15.1 概述……………………………………………………………………………………………… 10
15.2 仪器设备………………………………………………………………………………………… 10
15.3 试验材料………………………………………………………………………………………… 10
15.4 试验程序………………………………………………………………………………………… 11
15.5 结果判定………………………………………………………………………………………… 11
16 间接荧光抗体试验(IFAT)…………………………………………………………………………… 12
16.1 概述……………………………………………………………………………………………… 12
16.2 仪器设备………………………………………………………………………………………… 12
16.3 试验材料………………………………………………………………………………………… 12
16.4 试验程序………………………………………………………………………………………… 12
16.5 结果判定………………………………………………………………………………………… 13
17 综合判定……………………………………………………………………………………………… 13
附录A (规范性) 试剂配制……………………………………………………………………………… 14
附录B(规范性) 参考序列……………………………………………………………………………… 17
附录C(资料性) 非洲猪瘟参考资料…………………………………………………………………… 18
Ⅱ
SN/T1559—2024
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本 文件代替SN/T1559—2010《非洲猪瘟检疫技术规范》,与SN/T1559—2010相比,除结构调整
和编辑性改动外,主要技术变化如下:
———更改了聚合酶链式反应(PCR)(见第9章,2010版的第7章);
———更改了Taqman探针荧光PCR试验(见第10章,2010版的第8章);
———增加了重组酶介导的等温核酸扩增试验(荧光RAA 试验)(见第11章);
———增加了环介导等温扩增反应(LAMP试验)(见第12章);
———增加了间接ELISA 抗体试验(见第13章);
———增加了阻断ELISA 抗体试验(见第14章);
———增加了免疫过氧化物酶试验(IPT)(见第15章);
———增加了综合判定(见第17章);
———更改了试剂配制(见附录A,2010版的附录B);
———更改了非洲猪瘟参考资料(见附录C,2010版的附录A);
———删除了抗体ELISA 试验(见2010版的第9章);
———删除了免疫印迹试验(见2010版的第11章);
———删除了样品DNA 的制备(见2010版的附录C);
———删除了抗原制备方法(见2010版的附录D);
———删除了方法适用性(见2010版的附录E)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国杭州海关、中国检验检疫科学研究院、
中华人民共和国长沙海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国湛江
海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国大连海关、华南农业大学、天之泰生物技术研究院(珠
海)有限公司。
本文件主要起草人:罗宝正、何永强、吴绍强、周傲白雪、蔡一村、林祥梅、邵建宏、朱忠武、张娜、
李家侨、陈轩、史喜菊、陈德镁、曹琛福、李健、孙洁、贾赟、亓文宝、何秀敏。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
———2005年首次发布为SN/T1559.1—2005《非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程》、SN/T1559.2—
2005《非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程》、SN/T1559.3—2005《非洲猪瘟病毒红血球吸附
试验操作规程》;
———2010年第一次修订时,将SN/T1559.1—2005、SN/T1559.2—2005、SN/T1559.3—2005合
并为SN/T1559—2010;
———本次为第二次修订。
Ⅲ
SN/T1559—2024
非洲猪瘟检疫技术规范
1 范围
本文件规定了非洲猪瘟病毒(ASFV)红细胞吸附试验(HAD)、荧光抗体试验(FAT)、聚合酶链式
反应(PCR)、Taqman探针荧光PCR试验、重组酶介导的等温核酸扩增技术(RAA)、环介导等温扩增反
应(LAMP)、间接ELISA 抗体试验、阻断ELISA 抗体试验、免疫过氧化物酶试验(IPT)和间接荧光抗
体试验(IFAT)的技术要求。
本文件适用于家猪、野猪及其产品ASF的诊断和检疫。本文件中的核酸检测方法同时适用于环境
拭子中ASFV 核酸的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18648 非洲猪瘟诊断技术
GB19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T27401 实验室质量控制规范 动物检疫
SN/T5335 非洲猪瘟检测实验室生物安全操作技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件:
ASF:非洲猪瘟(Africanswinefever);
ASFV:非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus);
CPE:细胞病变效应(Cytopathiceffect);
Ct:循环阈值(Cyclethreshold);
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid);
EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid);
ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay);
FAT:荧光抗体试验(Fluorescentantibodytest);
FCS:胎牛血清(Fetalcalfserum);
FITC:异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate);
HAD:红细胞吸附(Haemadsorption);
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SN/T1559—2024
IFAT:间接荧光抗体试验(Indirectfluorescentantibodytest);
IPT:间接免疫过氧化氢酶试验(Indirectimmunoperoxidasetest);
LAMP:环介导等温扩增反应(Loop-mediatedisothermalamplification);
MEM:最低基础培养基(Minimumessentialmedium);
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersolution);
PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction);
RAA:重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinaseaidedamplification)。
5 实验室生物安全要求
ASFV属于一类动物病原微生物,开展ASF检测的实验室的设施设备配置应符合GB19489中生物安
全二级(BSL-2)及以上实验室的要求,其管理、技术、过程控制和结果质量控制均应符合GB/T27401规定。
ASF检测生物安全操作规范应符合SN/T5335的要求。
6 样品采集及制备
6.1 主要试剂
0.01mol/LpH7.4PBS(磷酸盐缓冲液):配制方法见附录A 中A.1。
6.2 样品采集
6.2.1 组织样品
采集病死猪或扑杀猪的组织样品,首选脾脏,其次为扁桃体、淋巴结、骨髓、肺脏、扁桃体和肾脏等。
扁桃体整体采集;脾脏、肺脏、肾脏等采集约50g;淋巴结选取出血严重的整体采集;骨髓采集长度约
5cm。将所采集样品放入PBS保存液中。
6.2.2 口鼻拭子
采集病死猪或者发病猪、同群猪的口鼻拭子,用医用棉签或植绒拭子撩拭猪口腔或鼻腔,收集分泌
物后将拭子浸入1mLPBS保存液中,剪断或折断露出部分,盖紧离心管盖,冷藏或冷冻保存。
6.2.3 全血样品
采血前用75%酒精棉球消毒采血部位后施行采血,采集待检猪的全血5mL,密封后冷藏或冷冻
保存。
6.2.4 血清样品
采血前用75%酒精棉球消毒采血部位后施行采血,采集待检猪的全血5mL,室温静置至析出血
清,将分离出的血清转移至离心管中,密封后冷藏或冷冻保存。
6.2.5 环境拭子样品
将拭子插入装有2mLPBS的采样管中,充分浸润后重复涂抹环境表面,并将拭子放回采样管
中,再次浸润后,取出重复涂抹采样,重复3次以上。对表面较大的物体表面要进行多点采集,至少选择
5个涂抹点,每个涂抹点面积不小于5cm×5cm。
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SN/T1559—2024
6.3 样品制备
口鼻拭子、全血、血清和环境拭子样品可直接编号用于实验室检测。
组织样品应置于组织匀浆器中研磨成糊状,加入灭菌的0.01mol/LPBS(pH7.4)制备10%组织匀
浆液,12000r/min离心10min,取上清液标记编号,立即进行病原检测或冷冻储存备用。
7 病毒红细胞吸附试验(HAD)
7.1 概述
由于受到ASFV 感染的猪单核细胞和巨噬细胞有吸附猪红细胞的现象,因此HAD可以用于ASF
诊断。少数减毒或者无毒力的ASFV 毒株感染细胞后不产生红细胞吸附现象,只有极少数不产生红细
胞吸附现象的ASFV 可以导致典型的急性ASF。
7.2 仪器设备
7.2.1 恒温培养箱。
7.2.2 倒置显微镜。
7.3 试验材料
7.3.1 本文件中所使用的水应符合GB/T6682三级水的要求。
7.3.2 0.9%氯化钠:配制方法见A.2。
7.3.3 0.01mol/LpH7.4PBS:配制方法见A.1。
7.3.4 青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素:使用前宜用上述PBS分别配成10000IU/mL、10mg/mL、
500IU/mL和500IU/mL的溶液。
7.3.5 肝素:使用前用0.9%氯化钠配制成1000IU/mL。
7.3.6 细胞基础培养液(如MEM 等):配制方法见A.3。
7.3.7 0.83%氯化铵溶液:配制方法见A.4。
7.3.8 1%猪红细胞:配制方法见A.5。
7.3.9 ASF标准毒株:从指定单位获得。
7.3.10 待检样品:包括肝素(或EDTA)抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。
7.4 试验程序
7.4.1 制备组织悬液
用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎,加入5mL~10mLpH7.4含抗生素的PBS,制成1∶10
(质量体积比)组织悬液(每毫升组织悬液的抗菌素含量为:青霉素1000IU,链霉素1mg,庆大霉素
50IU,制霉菌素50IU)。将组织悬液1000r/min离心5min,取上清保存在4℃备用。
7.4.2 制备白细胞
采取健康猪血,用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝(每毫升猪血含肝素100IU),700r/min离心30min,将上
层血清或血浆吸出备用。吸取中间淡黄色白细胞层,加3倍体积的0.83%氯化铵溶液,混合后室温孵育
15min,650r/min离心15min,吸去上清,剩下的细胞沉淀用细胞基础培养液或PBS洗涤3次,备用。
7.4.3 制备细胞培养液
将上述血清或血浆加入细胞基础培养液内,配制成细胞培养液,血清或血浆的终浓度为10%~
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30%,同时加入抗生素(抗生素含量为:青霉素的工作浓度100U/mL,链霉素的工作浓度0.1mg/mL)。
7.4.4 培养白细胞
将白细胞悬浮于细胞培养液中,使细胞含量为106 个/mL~107 个/mL,分装于160mm×16mm
的管中,每管1.5mL,将试管与水平面呈5°~10°倾斜放置,置于5%CO2 环境中,37 ℃培养2d~4d。
也可用96孔培养板进行细胞培养,每孔加入200μL白细胞培养液。
7.4.5 接种
每份组织上清接种3管/孔白细胞培养物,0.2mL/管或20μL/孔。如果样品保存不好,则10倍或
100倍稀释后再接种培养物。用有红细胞吸附作用的ASF标准毒株接种1管/孔白细胞培养物,作为
阳性对照。用无红细胞吸附作用的病毒接种1管/孔白细胞培养物,作为阴性对照。另留1管/孔白细
胞培养物不接种病毒,作空白对照。
7.4.6 加红细胞
37℃培养3d后,加入0.2mL/管或20μL/孔新鲜配制的1%猪红细胞,于37℃继续培养。
7.4.7 镜检
每天用显微镜或倒置显微镜检查CPE和红细胞吸附情况,连续检查7d~10d。
7.5 结果判定
将培养物轻轻摇动,置于低倍镜下(10×)观察。阳性对照的白细胞表面有大量猪红细胞附着,形成
玫瑰花环或桑葚体状;而阴性对照和空白对照的白细胞无红细胞附着,则对照成立,可进行结果判定。
被检样品白细胞表面有大量红细胞附着,形成玫瑰花环或桑葚体状的,判定为阳性。
被检样品白细胞表面无红细胞附着的,判定为阴性。
在无红细胞吸附的情况下出现白细胞数量减少的CPE可能是由于接种物的细胞毒性或伪狂犬病
毒或无红细胞吸附作用的ASFV 引起,应采集细胞沉淀物通过FAT或PCR进行鉴别。如果没有观察
到红细胞吸附和CPE,或FAT和PCR 试验阴性,则应收集培养物的上清液接种新鲜白细胞,连续传
3代。
所有分离培养物都应通过PCR和测序确诊。
8 病毒荧光抗体试验(FAT)
8.1 概述
FAT可检测疑似感染猪或实验室接种组织中的ASFV 抗原,鉴定无红细胞吸附现象的病毒。该
方法还可用于区分由ASFV 和其他病毒(如伪狂犬病毒)或细胞毒性接种物引起的CPE。对于亚急性
或慢性感染,FAT的敏感性会降低。
8.2 仪器设备
8.2.1 冷冻切片机。
8.2.2 恒温培养箱。
8.2.3 荧光显微镜。
8.2.4 冰箱。
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8.3 试验材料
8.3.1 ASF标准毒株从指定单位获得。
8.3.2 FITC标记的ASFV 抗体。
8.3.3 蒸馏水(pH7.4),用盐酸或氢氧化钠调整蒸馏水的pH 至7.4。
8.3.4 0.01mol/LpH7.4PBS,配制方法见A.1。
8.3.5 丙酮:使用前置冰箱预冷。
8.4 试验程序
8.4.1 待检组织的制备
8.4.1.1 组织切片、印片或涂片
将待检组织制成厚度为4μm~7μm 的冰冻切片,也可制成印片或涂片。
8.4.1.2 白细胞培养物涂片
用已接种待检组织的白细胞培养物涂片,制成待检标本。用阳性对照的细胞培养物涂片,制成阳性
对照样品。用阴性对照的细胞培养物涂片,制成阴性对照样品。
8.4.2 固定
分别将上述样品在室温下自然风干,用预冷丙酮固定10min。
8.4.3 加荧光抗体
在8.4.2的样品上滴加FITC标记的ASFV 抗体进行染色,然后放入湿盒内,于37℃恒温培养箱内
着染1h。
8.4.4 漂洗
将8.4.3的样品浸入PBS中洗涤4次。
8.4.5 镜检
在8.4.4的样品上滴加1滴缓冲甘油,置于带有适当光栅和滤光片的荧光显微镜下观察。
8.5 结果判定
阴性对照样品的细胞无荧光产生,阳性对照样品的细胞出现特异性的粒状胞浆荧光,则试验成
立,可进行结果判定。
被检样品的细胞胞浆内出现荧光的,判定为阳性。
被检样品的细胞胞浆内无荧光出现的,判定为阴性。
9 聚合酶链式反应(PCR)
9.1 概述
使用特异性引物对病毒基因组的保守区(基因序列按附录B)进行PCR扩增,该技术可以检测或鉴
定所有基因型的ASFV 核酸,包括无红细胞吸附现象的病毒和毒力弱的病毒核酸,且可用于检测腐烂
的组织和已失活的病毒核酸。
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9.2 仪器设备
9.2.1 PCR扩增仪。
9.2.2 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
9.2.3 电泳装置,包括电泳槽和电泳仪。
9.2.4 凝胶成像系统。
9.2.5 微量移液器(1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL等不同规格)及配套吸头。
9.3 主要试剂
9.3.1 DNA 提取试剂盒。
9.3.2 PCR预混液(2×):反应缓冲液、TaqDNA聚合酶(0.05U/μL)、4mmol/L氯化镁和0.4mmol/L的
dNTP。
9.3.3 电泳缓冲液TAE:配制方法见A.6。
9.3.4 2%琼脂糖凝胶:配制方法见A.7。
9.3.5 10×上样缓冲液。
9.3.6 DNA 分子质量标准:500bp的商业化DNA 梯度标准。
9.3.7 无核酸酶水。
9.3.8 引物:
上游引物5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3';
下游引物5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3'。
9.4 核酸提取
采用商品化的核酸提取试剂盒提取采集样品中的病毒核酸,并按其说明书使用。核酸提取应设阳
性和阴性对照。阳性对照样品为ASFV 核酸阳性样品(全血:含EDTA 抗凝剂,血清或10%的组织匀
浆或细胞培养上清液)或合成质粒;阴性对照样品为ASFV 核酸阴性样品(全血:含EDTA 抗凝剂,血清
或10%的组织匀浆或细胞培养上清液)。
9.5 试验程序
9.5.1 反应体系
按以下组成配制反应液:
PCR预混液(2×) 12.5μL
上游引物(5pmol/μL) 1μL
下游引物(5pmol/μL) 1μL
无核酸酶水 8.5μL
将上述反应液分装于PCR反应管,23μL/管,每管分别加入2μL核酸提取液。试验应设立阳性、
阴性和空白对照。阳性对照为ASF阳性样品或合成质粒提取的核酸提取液,阴性对照为ASF阴性样
品提取的核酸,空白对照为无核酸酶水。
使用经批准的商品化PCR试剂盒时,按相应说明书使用。
9.5.2 反应条件
密封反应样品管,瞬时离心后放入PCR扩增仪中,按下列程序运行:95℃预变性10min;95℃ 变
性15s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环;72℃终延伸7min。
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9.5.3 扩增及产物电泳
反应结束后,将2.5μL的10×上样缓冲液加入PCR反应混合物中。将所有样品和对照按编号加
入对应2%琼脂糖凝胶中,150V~200V 恒定电压下电泳30min,电泳结束后用凝胶成像仪记录观察
结果。
9.6 结果判定
阳性对照出现一条257bp的条带,阴性对照和空白对照无任何条带,试验成立,可进行结果判定。
被检样品出现和阳性对照大小一致的257bp特异性条带的,判为ASFV 核酸阳性。
被检样品没有出现257bp的特异性条带的,判为ASFV 核酸阴性。
10 Taqman探针荧光PCR 试验
10.1 概述
Taqman探针荧光PCR 试验方法具有灵敏度高、特异性强的特点。本试验方法2已被证明在
ASFV 感染早期和病毒血症水平通常很低的长期慢性感染动物中具有较高的检测灵敏度。
10.2 仪器设备
10.2.1 荧光PCR扩增仪。
10.2.2 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
10.2.3 微量移液器(1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL等不同规格)及配套吸头。
10.3 主要试剂
10.3.1 DNA 提取试剂盒。
10.3.2 荧光PCR反应预混液(2×)。
10.3.3 无核酸酶水。
10.3.4 引物探针:
方法1:上游引物5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3';
下游引物5'-GATACCACAAGATC(A/G)GCCGT-3';
探针FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA。
方法2:上游引物5'-CCCAGG(A/G)GATAAAATGACTG-3';
下游引物5'-CACT(A/G)GTTCCCTCCACCGATA-3';
探针FAM-TCCTGGCC(A/G)ACCAAGTGCTT-BHQ1。
10.4 核酸提取
核酸提取方法见9.4。
10.5 试验程序
10.5.1 反应体系
10.5.1.1 方法1
每个反应配制22μL反应液,组成如下:
荧光PCR预混液(2×) 12.5μL
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上游引物(50pmol/μL) 1 μL
下游引物(50pmol/μL) 1 μL
探针(5pmol/μL) 1μL
无核酸酶水 6 .5μL
将22μL反应液加入PCR反应管中,每管加入3μL核酸提取液。每次试验应设立阳性、阴性和空
白对照。阳性对照为标准ASF阳性样品或合成质粒提取的核酸,阴性对照为ASF阴性样品提取的核
酸,空白对照为无核酸酶水。
10.5.1.2 方法2
每个反应配制18μL反应液,组成如下:
荧光PCR预混液(2×) 1 0μL
上游引物(20pmol/μL) 0.4μL
下游引物(20pmol/μL) 0.4μL
探针(10pmol/μL) 0.2μL
无核酸酶水 8 .5μL
将18μL反应液加入PCR反应管中,每管加入2μL的核酸提取液。每次试验应设立阳性、阴性和
空白对照。阳性对照为标准ASF阳性样品或合成质粒提取的核酸,阴性对照为ASF阴性样品提取的
核酸,空白对照为无核酸酶水。
使用经批准的商品化荧光PCR试剂盒时,按相应说明书使用。
10.5.2 反应条件
密封反应管,瞬时离心后放入荧光PCR扩增仪中,按下列程序运行。
方法1:50℃预热2min;95℃预变性10min;95℃变性15s,58℃退火延伸1min,40个循环,在
每一循环的58℃时收集FAM 荧光信号。
方法2:95℃预变性5min;95℃变性10s,60℃退火延伸30s,45个循环,在每一循环的60℃时
收集FAM 荧光信号。
10.6 结果判定
方法1:阳性对照的Ct值<40且出现特异性扩增曲线,阴性对照无Ct值或Ct值>40且无特异性
扩增曲线,试验成立,可进行结果判定。
被检样品Ct值<40(强阳性样品Ct值<30)且出现特异性扩增曲线,则判定为ASFV 核酸阳性。
被检样品无Ct值或Ct值>40且无特异性扩增曲线,判为ASFV 核酸阴性。
方法2:阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线,阴性对照无Ct值或Ct值≥40且无特异性
扩增曲线,试验成立,可进行结果判定。
被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,则判定为ASFV 核酸阳性。
被检样品无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线,判定为ASFV 核酸阴性。
被检样品38<ct值<40且出现特异性扩增曲线时,需要进行复检。模板量加倍(4μldna 模板)<br=""> 进行1次复检,3个重复;有2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线,则判定为ASFV 核酸阳性,否
则判定为ASFV 核酸阴性。
11 重组酶介导的等温核酸扩增试验(荧光RAA 试验)
荧光RAA 试验按照GB/T18648执行。
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SN/T1559—2024
12 环介导等温扩增反应(LAMP试验)
12.1 仪器设备
12.1.1 恒温荧光基因检测仪。
12.1.2 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
12.1.3 微量移液器(1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL等不同规格)及配套吸头。
12.2 主要试剂
12.2.1 DNA 提取试剂盒。
12.2.2 LAMP反应管。
12.2.3 LAMP缓冲液。
12.2.4 BstDNA 聚合酶。
12.2.5 SYBRGreen荧光染料。
12.2.6 无核酸酶水。
12.2.7 引物:
引物F3:5'-CGTATCCGATCACATTACCT-3'。
引物B3:5'-ATATGACCACTGGGTTGG-3'。
引物FIP:5'-AGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTAAACATTTCCGTAACTGCTCA-3'。
引物BIP:5'-ACGGAGGCAATGCGATTAAAATATTCCTCCCGTGGCTTC-3'。
引物LB:5'-CCGATGATCCGGGTGCGAT-3'。
12.3 核酸提取
核酸提取方法见9.4。
12.4 试验程序
12.4.1 反应体系
每个反应配制23μL反应液,组成如下:
反应缓冲液 12.5μL
BstDNA 聚合酶 1μL
引物F3(5pmol/μL) 1μL
引物B3(5pmol/μL) 1μL
引物FIP(40pmol/μL) 1μL
引物BIP(40pmol/μL) 1μL
引物LB(20pmol/μL) 1μL
SYBRGreen荧光染料 0.5μL
无核酸酶水 4μL
将23μL反应液加入LAMP反应管中,每管加入2μL核酸提取液。每次试验应设立阳性、阴性和
空白对照。阳性对照为标准ASF阳性样品或合成质粒提取的核酸,阴性对照为ASF阴性样品提取的
核酸,空白对照为无核酸酶水。
使用商品化荧光LAMP试剂盒时,按相应说明书使用。
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SN/T1559—2024
12.4.2 反应条件
密封反应样品管,瞬时离心后放入恒温荧光基因检测仪中,按下列程序运行:扩增温度63 ℃
50min,每隔30s收集荧光信号。
12.5 结果判定
阳性对照出现特异性起峰曲线,阴性对照和空白对照无起峰时间或≥10 min无特异性起峰曲
线,试验成立。
被检样品有特异性扩增曲线的,判定为ASFV 核酸阳性。
被检样品无特异性扩增曲线的,判定为ASFV 核酸阴性。
13 间接ELISA 抗体试验
间接ELISA 抗体试验按照GB/T18648执行。
14 阻断ELISA 抗体试验
阻断ELISA 抗体试验按照GB/T18648执行。
15 免疫过氧化物酶试验(IPT)
15.1 概述
本方法适用于对下列样品的确认:来自ASF无疫区、ELISA 结果呈阳性的血清样品,来自ASF疫
区、ELISA 检测结果不确定的血清样品。
15.2 仪器设备
15.2.1 荧光显微镜。
15.2.2 倒置显微镜。
15.2.3 CO2 培养箱和普通恒温培养箱。
15.2.4 平板振荡器。
15.3 试验材料
15.3.1 ASF标准毒株:从指定单位获得。
15.3.2 ASF标准阴性血清和标准阳性血清。
15.3.3 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)或MS细胞(猴静态细胞monkeystable)。
15.3.4 蛋白质A 过氧化物酶结合物。
15.3.5 FCS。
15.3.6 被检血清:56℃灭活30min。
15.3.7 蒸馏水(pH7.4):用盐酸或氢氧化钠调整蒸馏水的pH 至7.4。
15.3.8 细胞基础培养液:配制方法见A.3。
15.3.9 细胞生长培养液:在细胞基础培养液中加入10%胎牛血清即可。
15.3.10 细胞维持液:在细胞基础培养液中加入5%胎牛血清即可。
15.3.11 0.01mol/LpH7.4PBS:配制方法见A.1。
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SN/T1559—2024
15.3.12 底物显色液配制见A.14,封闭缓冲液配制见A.15。
15.3.13 丙酮和甲醇:使用前于冰箱-20℃预冷。
15.4 试验程序
15.4.1 病毒培养
培养MS细胞或Vero细胞至96孔细胞培养板中,置于5%CO2 环境中,37 ℃±3 ℃培养24h
(Vero细胞)或48h(MS细胞)。当细胞生长至80%时,接种100μL感染复数为0.025~0.05的ASFV
稀释液,于5%CO237℃±3℃培养18h±1h(Vero细胞)或24h±1h(MS细胞)。MS细胞培养2h
后,在细胞基础培养液中添加4%的FCS,将体积增加到200μL。
15.4.2 细胞固定
弃掉病毒培养液,使用预冷的含有70%甲醇和30%丙酮的溶液在室温下固定ASFV 感染的细胞
培养板8min±2min。用PBS洗3次~5次,每次5min。固定和干燥后的细胞培养板可直接使用或
储存在-10℃下。
15.4.3 封闭步骤
取出细胞培养板,待恢复室温后加入100μL/孔封闭缓冲液,于37℃±2℃在平板振荡器上封闭1h。
15.4.4 样品预孵育
用含2%FCS的封闭缓冲液将待检血清样品、阳性血清和阴性血清对照稀释40倍。取100μL/孔
稀释后的样品至96孔板中,37℃±2℃条件下在平板振荡器上孵育1h。
15.4.5 样品孵育
1h后弃去细胞培养板中的封闭缓冲液,取100μL15.4.4中预孵育的样品和对照加入细胞培养板
中,37℃±2℃条件下在平板振荡器上孵育45min。
15.4.6 漂洗
弃去细胞培养板中的液体,加入100μL/孔的PBS,37℃±2℃条件下洗涤3次,每次5min。
15.4.7 二抗
将蛋白质A 过氧化物酶结合物做5000倍稀释,取100μL/孔加入细胞培养板,37℃±2℃条件下
在平板振荡器上孵育45min。
15.4.8 漂洗
弃去蛋白质A 过氧化物酶结合物后,加入100μL/孔的PBS,37 ℃±2 ℃条件下洗涤3次,每次
5min。
15.4.9 显色
在细胞板内加入50μL/孔的底物显色液,室温条件下孵育5min~10min。待出现红褐色时,弃去
显色液,加入100μL/孔的PBS终止反应。
15.5 结果判定
阳性对照孔的细胞浆中出现红褐色着染,阴性对照细胞浆中无红色着染时,试验成立,可进行结果
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判定。
被 检样品孔的细胞浆中出现红褐色着染,判定为ASFV 抗原阳性;否则判定为ASFV 抗原阴性。
16 间接荧光抗体试验(IFAT)
16.1 概述
本方法适用于对下列样品的确认:来自ASF无疫区、ELISA 结果呈阳性的血清样品,来自ASF疫
区、ELISA 检测结果不确定的血清样品。
16.2 仪器设备
16.2.1 荧光显微镜。
16.2.2 倒置显微镜。
16.2.3 CO2 培养箱和普通恒温培养箱。
16.2.4 冰箱。
16.3 试验材料
16.3.1 ASF标准毒株:从指定单位获得。
16.3.2 ASF标准阴性血清和标准阳性血清。
16.3.3 FITC标记抗猪免疫球蛋白。
16.3.4 PK-15细胞(猪肾细胞)或Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。
16.3.5 FCS。
16.3.6 被检血清:56℃灭活30min。
16.3.7 蒸馏水(pH7.4):用盐酸或氢氧化钠调整蒸馏水的pH 至7.4。
16.3.8 细胞基础培养液:配制方法见A.3。
16.3.9 细胞生长培养液:在细胞基础培养液中加入10%胎牛血清即可。
16.3.10 细胞维持液:在细胞基础培养液中加入5%胎牛血清即可。
16.3.11 0.01mol/LpH7.4PBS:配制方法见A.1。
16.3.12 缓冲甘油:使用9mL中性无自发荧光的甘油(分析纯)加1mL0.01mol/LpH7.4PBS。
16.3.13 丙酮:使用前于冰箱-20℃预冷。
16.4 试验程序
16.4.1 病毒培养
用细胞生长液培养PK-15细胞或Vero细胞,待细胞长成单层后,弃去培养液,接种ASFV,使病毒
液刚好完全覆盖细胞。于5%CO237 ℃吸附0.5h~2h,弃去病毒液,更换新鲜的细胞维持液,于5%
CO237℃培养,逐日观察,待50%以上细胞出现CPE 时收获,同时培养未感染病毒的细胞,供对照
使用。
16.4.2 抗原片制备
将收获的ASFV 感染细胞配制成浓度为5×105 个/mL的细胞悬液,滴2滴~3滴于载玻片上,涂
成均匀薄片,室温下自然风干,用预冷丙酮固定10min后,制成抗原片。置-20℃保存。
16.4.3 细胞对照片制备
将长成细胞单层的PK-15细胞或Vero细胞按16.4.2的方法制备细胞对照片。
12
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16.4.4 加样
用PBS将被检血清做适当稀释后,取适量加于抗原片和细胞对照片上,放入湿盒内,于37℃温育1h。
按上述操作,制备阳性和阴性对照样品。
16.4.5 漂洗
用PBS分别漂洗4次,每次5min。最后用蒸馏水漂洗3min,沥干水分。
16.4.6 加抗猪荧光抗体
分别滴加工作浓度的FITC标记抗猪免疫球蛋白。放入湿盒,于37℃温育1h。
16.4.7 漂洗
重复步骤16.4.5操作,自然风干。
16.4.8 镜检
分别滴加缓冲甘油1滴,在带有适当光栅和滤光片的荧光显微镜下观察。
16.5 结果判定
阳性对照样品的细胞浆出现荧光,阴性对照和细胞对照样品的细胞浆无荧光,试验成立,可进行结
果判定。
被检样品的细胞胞浆出现荧光的,判定为ASFV 抗体阳性。
被检样品的细胞胞浆无荧光的,判定为ASFV 抗体阴性。
17 综合判定
17.1 有ASF典型临床症状与病理变化的疑似病例(临床症状和病理变化见附录C),HAD 检测为阳
性,或PCR、Taqman探针荧光PCR、荧光RAA 方法、LAMP方法中任意一种方法检测出核酸阳性
的,或FAT、IPT检出抗原阳性,或ELISA 方法、IFAT方法检出抗体阳性的,判定为ASF病例;经PCR
检测为阴性的,还需使用Taqman探针荧光PCR方法、荧光RAA 方法、LAMP方法中任一方法进行复
检,若任意一种方法检出阳性,则判定为ASF病例。
17.2 无明显临床症状的样品(临床症状和病理变化见附录C),HAD检测为阳性,或PCR、Taqman探
针荧光PCR、荧光RAA 方法、LAMP方法中任意一种方法检测为核酸阳性,或FAT、IPT 中任意一种
方法检测为抗原阳性的,判定为ASFV 感染;经PCR或FAT、IPT检测为阴性的,还需使用Taqman探
针荧光PCR、荧光RAA 方法、LAMP方法、ELISA 方法进行复检,若任意一种方法检出阳性,则判定为
ASFV 感染。
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SN/T1559—2024
附 录 A
(规范性)
试剂配制
A.1 0.01mol/LpH7.4PBS(磷酸盐缓冲液)
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.26g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2.89g
氯化钠(NaCl) 8.50g
加蒸馏水至 1000mL
调pH 至7.4,103kPa高压蒸汽灭菌30min,室温或4℃冰箱保存。
A.2 0.9%氯化钠
氯化钠 9.00g
加蒸馏水至 1000mL
溶解,混匀,112kPa高压灭菌15min。
A.3 细胞基础培养液
MEM 10.00g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.20g
加双蒸水至 1000mL
用0.22μm 微孔滤膜过滤除菌,分装,4℃保存备用。
A.4 0.83%氯化铵溶液
氯化铵 8.30g
加蒸馏水至 1000mL
溶解,混匀,112kPa高压灭菌15min。
A.5 1%猪红细胞
无菌采取健康猪的血液,加入肝素(每毫升猪血含肝素100IU)充分混匀,700r/min离心30min,吸去
血浆和白细胞,留下红细胞,用10倍量的0.01mol/LPBS洗涤3次,每次以700r/min离心10min。
最后用0.01mol/LpH7.4PBS配成体积分数为1%的猪红细胞。
A.6 电泳缓冲液TAE(50倍)
三羟甲基甲烷碱(Trisbase) 242g
冰乙酸 57.1mL
0.5mol/LpH8.0乙二胺四乙酸(EDTA) 100mL
蒸馏水 100mL
待上述混合物完全溶解后,加蒸馏水至1000mL,置4℃冰箱中备用。如配制2%的琼脂糖凝胶和
用作电泳缓冲液,则用蒸馏水稀释50倍成TAE缓冲液。
A.7 2%琼脂糖凝胶板
取1g琼脂糖(电泳纯)加入50mLTAE缓冲液中,加热充分溶解后,加入最终浓度为0.5μg/mL
14
SN/T1559—2024
的溴化乙锭,冷却至60℃后,倒入凝胶板中,在距离底板0.5mm 的位置上放置梳子,以便加入琼脂糖
后可以形成完好的加样孔,凝胶的厚度为4mm,待凝胶完全凝固后,小心移去梳子,将凝胶板放入电泳
槽中,加入恰好没过胶面约1mm 深的足量电泳缓冲液。
A.8 包被缓冲液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)
碳酸钠(Na2CO3) 0.318g
碳酸氢钠(NaHCO3) 0.588g
去离子水 200mL
用0.22μm 膜过滤除菌,室温保存备用。
A.9 封闭缓冲液(含2%BSA 的pH7.4PBS)
pH7.4PBS 1000mL
BSA 20g
现配现用。
A.10 稀释缓冲液(含1%BSA 的pH7.4PBS)
pH7.4PBS 1000mL
BSA 10g
现配现用。
A.11 洗涤缓冲液(0.05%吐温-20)
pH7.4PBS 1000mL
吐温-20 0.5mL
现配现用。
A.12 TMD 底物溶液
底物溶液A:
TMB 20 0 m g
无水乙醇 1 00 m L
蒸馏水加至1000mL。
底物溶液B:
磷酸氢二钠(Na2HPO4,分析纯) 7 1 .7g
柠檬酸(C6H8O7,分析纯) 9 .33 g
0.75%过氧化氢尿素 6 .4 m L
蒸馏水加至1000mL,调整pH 至5.0~5.4。
底物溶液A 与底物溶液B1∶1配比使用,现配现用。
A.13 终止液(2mol/L硫酸)
111mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889mL去离子水中,室温分装保存。
A.14 底物显色液
原液:
AEC(3-氨基-9-乙基咔唑) 2 0 mg
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SN/T1559—2024
二甲基甲酰胺 2 .5 m L
溶解后,避光保存在4℃±3℃。
乙酸缓冲液:
溶液A:1.155mL冰乙酸溶于100mL水中,室温保存。
溶液B:2.72g乙酸溶于100mL水中,室温保存。
取300μL原液和5mL乙酸缓冲液,加入5μL双氧水,现配现用。也可采用等效的商品化显色试
剂盒。
A.15 封闭缓冲液(含5%脱脂奶粉的pH7.4PBS)
pH7.4PBS 100mL
吐温-20 0.05mL
脱脂奶粉 5g
现配现用。
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SN/T1559—2024
附 录 B
(规范性)
参考序列
非洲猪瘟p72基因序列(1941bp)(NCBI序列号MK554698.1)如下:
ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATT
ATATTGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGT
TATGGGAAACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATT
TTAATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGC
ATACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTT
TTTCCATGATATGGTGGGCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCT
CCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACG
GATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTT
TGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTACTACTGCGAA
TACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGAC
GAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATG
ACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCTCTCC
TATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAA
TGATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAG
AACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATCACGGACGCAACGT
ATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACT
ATCAGCCCCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCT
TGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCG
CAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCT
GGACGCCCCAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATG
AAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATAACCTGTTTGTAACCCCTGAAATAC
ACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGAC
CCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAA
TATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACC
GAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGA
GATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATAT
TAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCAT
GGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACT
ACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTT
GAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATT
TTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATC
GGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACC
TAA
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SN/T1559—2024
附 录 C
(资料性)
非洲猪瘟参考资料
C.1 非洲猪瘟概述
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的
猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病,以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。世界动物
卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。ASFV 是非洲猪瘟病毒
科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员,钝缘蜱属的软蜱(尤其是白毛钝缘蜱和游走钝缘蜱)是ASFV 的储存
库和传播载体。家猪和欧亚野猪高度易感,无明显的品种、日龄和性别差异。非洲猪瘟临床症状与古典
猪瘟、高致病性猪蓝耳病、猪丹毒等疫病相似,需通过实验室检测进行鉴别诊断。2018年8月3日,我国确
诊首例非洲猪瘟疫病。
非洲猪瘟变异株包括基因缺失株、自然变异株、自然弱毒株等,与2018年传入的非洲猪瘟毒株相
比,该类毒株的基因组序列、致病力等发生明显变化。生猪感染该类毒株后,潜伏期延长,临床表现轻
微,后期可出现关节肿胀、皮肤出血型坏死灶,感染母猪产仔性能下降、死淘率增高,出现流产死胎/木乃
伊胎等。与传统的流行毒株相比,生猪感染该类毒株后排毒滴度低、间歇性排毒,难以早期发现。
C.2 非洲猪瘟临床症状
非洲猪瘟自然感染后潜伏期长短不一,为4d~19d。非洲野猪对ASFV 有很强的抵抗力,感染病
毒后一般不会出现典型症状。家猪对非洲猪瘟的易感性很强,感染后很快出现典型症状。不同毒株致
病性有所差异,强毒力毒株可导致感染猪在12d~14d内100%死亡,中等毒力毒株造成的病死率一般
为30%~50%,低毒力毒株仅引起少量猪死亡。根据临床症状可以分为4种,分别为最急性、急性、亚
急性感染和慢性感染。
a) 最急性型:无明显临床症状突然死亡。
b) 急性型:体温可高达42 ℃,沉郁,厌食,耳、四肢、腹部皮肤有出血点,可视黏膜潮红、发绀。
眼、鼻有黏液脓性分泌物;呕吐;便秘,粪便表面有血液和黏液覆盖;腹泻,粪便带血。共济失
调或步态僵直,呼吸困难,病程延长则出现其他神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达
100%。病程4d~10d。
c) 亚急性型:临床症状与急性相同,但症状稍轻,病程持续时间稍长。
d) 慢性型:波状热,呼吸困难,湿咳。消瘦或发育迟缓,体弱,毛色暗淡。关节肿胀,皮肤溃疡。
死亡率低。病程2个月~15个月。
感染非洲猪瘟变异株的猪出现嗜睡、轻触不起、采食量减少、发热、皮肤发红、关节肿胀/坏死、咳喘、
腹式呼吸等症状,育肥猪死淘率增高,母猪流产或出现死胎/木乃伊胎。
C.3 非洲猪瘟病理变化
典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血,肾脏、肺脏表面有出血点,心内膜和心外膜有大量出血
点,胃、肠道黏膜弥漫性出血;胆囊、膀胱出血;肺脏肿大,切面流出泡沫性液体,气管内有血性泡沫样黏
液;脾脏肿大,易碎,呈暗红色至黑色,表面有出血点,边缘钝圆,有时出现边缘梗死;颌下淋巴结、腹腔淋
巴结肿大,严重出血。最急性型的个体可能不出现明显的病理变化。
C.4 非洲猪瘟病毒的抵抗力
ASFV对各种消毒剂具有一定的抵抗性,70℃下30min可使病毒灭活。在适宜、蛋白质丰富的环
18
SN/T1559—2024
境中,ASFV 在适合的温度和pH 范围内可以保持活性。因此,非洲猪瘟病毒在排泄物、尸体中的存活
时间较长,保持感染性可达15周(冻肉中可能时间更长)。以上不同条件下的病毒存活情况对非洲猪瘟
的传播具有非常重要的意义,如果用未煮熟的肉、未充分熏制的肉、干肉、腌猪肉、血液、尸体和胴体喂猪
或丢弃在猪或野猪可能采食的公共垃圾堆放处,有造成病毒传播的风险。某些吸血昆虫(如厩螫蝇),已
被证明能够在吸取病猪血液后至少24h内保留并传播ASFV,这与猪群内传播相关。
19
SN/T1559—2024</ct值<40且出现特异性扩增曲线时,需要进行复检。模板量加倍(4μldna>