SN/T 1087-2024 Q热检疫技术规范

ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T1087—2024
代替SN/T1087—2011
Q 热检疫技术规范
QuarantineprotocolforQfever
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本 文件代替SN/T1087—2011《Q 热检疫技术规范》,与SN/T1087—2011相比,除结构调整和编
辑性改动外,主要技术变化如下:
———增加了聚合酶链式反应(PCR)(见第9章);
———增加了实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)(见第10章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国温州
海关。
本 文件主要起草人:王建昌、王素华、佟铁铸、王金凤、鱼海琼、鄢志强、柯忠哲、马保华、刘立兵、
孙晓霞。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
———2002年首次发布为SN/T1087—2002,2011年第一次修订;
———本次为第二次修订。
Ⅰ
SN/T1087—2024
Q 热检疫技术规范
1 范围
本文件描述了Q 热的病原分离鉴定、聚合酶链式反应、实时荧光聚合酶链式反应和血清学试验检
测方法,其中血清学试验包括间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和补体结合试验。
本文件适用于进出境牛、羊等易感动物Q 热的检疫和诊断,也适用于动物组织、血液、奶液、毛和皮
等动物产品和蜱中Q 热病原的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
SN/T2984—2011 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件:
C.Burnetii:贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii);
CPE:致细胞病变效应(Cytopathiceffect);
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid);
ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay);
FAM:6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein);
FITC:异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate);
HEL:人胚肺成纤维细胞(Humanembryoniclungfibroblasts);
IFA:间接免疫荧光试验(Indirectimmunofluorescenceassay);
OD值:光密度值(Optimaldensity);
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsolution);
PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction);
QFever:Q 热(Queryfever);
VBD:巴比妥缓冲液(Barbituratebuffer)。
1
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5 试验操作生物安全要求
本文件所列各项试验操作应按照SN/T2984—2011中3.1的规定执行,具体防护措施及要求应按
照GB19489的规定执行。
6 临床诊断
6.1 疫病概述
Q 热概述见附录A。
6.2 临床症状
家畜患Q 热的症状主要有怀孕后期的流产、早产、死产、弱仔、胎衣不下、子宫内膜炎和不育。小反
刍兽患Q 热常伴发畜群突然流产,康复后感染可持续多年或终生。
6.3 剖检变化
流产胎儿的脾脏、肝脏、肾脏和生殖器官有大小不一的坏死灶和增生组织或肉芽肿。
6.4 结果判定
易感动物出现上述临床症状和剖检变化,可初步判定为疑似Q 热,确诊需要进行实验室诊断。
7 样品采集、保存、运送与处理
7.1 采样技术要求
样品采集、运输和保存应按照SN/T2123的规定执行。
7.2 样品采集
7.2.1 组织样品
采集出现流产、死胎或弱犊、胎衣不下、子宫内膜炎的病畜胎盘子叶、肝、肺、流产胎儿皱胃内容物等
组织样品,用灭菌剪刀剪取所需器官的组织块,每个组织块应单独放在已消毒的容器内,每份质量为
10g~50g,注明采样日期、组织和动物名称等。
7.2.2 全血样品
用一次性含有非肝素(EDTA 等)抗凝剂的真空采血管,由动物静脉无菌采血,充分混匀后静置。
7.2.3 血清样品
用一次性真空血清采血管,由动物静脉无菌采血,连续摇匀,待血清凝集后,分离血清。
7.2.4 分泌物和粪便拭子
用医用棉签在分娩或流产动物以及病死、发病动物的肛门或阴道内旋转数圈并蘸取少量粪便或分
泌物,将采集后的棉拭子立即放入盛有2mLPBS的采样管中。
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7.2.5 生毛皮、毛、绒和鬃样品
从同批样品的不同部位共抽样5g~10g,装入无菌采样袋,密封。
7.2.6 蜱样品
牛、羊等动物身下铺放白布,使用乙醚(或松节油、煤油、三氯甲烷)涂抹蜱头部,待蜱自行从动物身
体脱落。用镊子摘取脱落蜱,放置在1.5mL灭菌离心管中。对于动物皮毛携带的蜱,可直接用镊子摘
取,放置在1.5mL灭菌离心管中。
7.2.7 奶液样品
采集奶液于灭菌50mL离心管中,尽量于清晨采取,采前用温热毛巾将乳房擦拭干净,用2%碘伏
将乳头消毒,将头3把~4把乳汁弃去,采集后续奶液。
7.3 样品保存及运送
采集的样品应在取样后4℃冷藏24h内送至实验室,应附有标签或采样单,表明采样地点、动物来
源、采样数目、临床症状和采样时间、采样人等信息。
7.4 样品处理
7.4.1 组织样品
取适量组织样品,剪碎,按1∶5的比例加入灭菌的含抗生素(链霉素100μg/mL~200μg/mL和
庆大霉素50μg/mL~100μg/mL)的0.1 mol/LPBS(pH7.4),用组织研磨仪充分研磨5 min~
10min,制备成组织匀浆液;移入离心管,充分振荡,75 ℃温浴0.5h~1h;15000g 离心10min,弃上
清,加1mLPBS,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000g 离心10min,弃上清,收集沉淀物,置于-20 ℃
贮存备用。
7.4.2 全血样品
取1mL~2 mL 全血样品,编号,15000g 离心10 min,弃上清。加等体积灭菌双蒸水充分振
荡,15000g 离心10min,弃上清。若红细胞裂解不完全,需采用灭菌双蒸水重复洗涤。收集沉淀物,置
于-20℃贮存备用。
7.4.3 血清样品
无菌分离血清,装入2.0mL离心管中,编号,用于抗体检测。
7.4.4 棉拭子样品
将采集的分泌物拭子和粪便拭子加入1mL灭菌的0.1mol/LPBS(pH7.4),于振荡器上充分振荡
混匀,将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子,编号,置于-20℃贮存备用。
7.4.5 生毛皮、毛、绒和鬃样品
取1g样品放入灭菌三角瓶中,加入30mL4 ℃预冷的0.5% TritonX-100PBS溶液,将瓶口塞
严,冰浴或置于4℃冰箱内,间或摇动1h。将瓶中液体倒入50mL灭菌离心管中,盖住管口,3000g 离
心10min去除样品中大的颗粒。取上层悬液15000g 离心10min,弃上清,加1mLPBS充分振荡混
匀;将沉淀悬浮液移入1.5mL 离心管,15000g 离心10min,弃上清,收集沉淀物,置于-20 ℃贮存
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备用。
7.4.6 蜱样品
将采集的蜱使用75%乙醇清洗后,研磨,置于-20℃贮存备用。
7.4.7 奶液样品
采集10mL新鲜奶液,加100μLTritonX-100,振荡混匀,2500g 离心20min,弃上清,加1mL
PBS,充分振荡混匀;将沉淀悬浮液移入1.5mL离心管,15000g 离心10min,弃上清,收集沉淀物,置
于-20℃贮存备用。
8 病原分离和鉴定
8.1 材料准备
8.1.1 器材
8.1.1.1 荧光显微镜。
8.1.1.2 倒置显微镜。
8.1.1.3 二氧化碳培养箱。
8.1.1.4 5cm2 细胞培养瓶。
8.1.1.5 24孔平底细胞培养板。
8.1.1.6 带盖湿盒。
8.1.1.7 组织研磨仪。
8.1.1.8 冷冻离心机(-10℃~+40℃)。
8.1.2 试剂
8.1.2.1 无C.Burnetii 抗体犊牛血清。
8.1.2.2 人胚肺成纤维细胞(HEL)。
8.1.2.3 C.Burnetii 标准菌株和标准阳性、阴性血清、C.Burnetii 荧光抗体。
8.1.2.4 溶液及细胞培养液:见附录B。
8.1.2.5 链霉素、庆大霉素。
8.2 病原分离
按常规方法培养HEL单层细胞,倒去培养液,接种处理过的样品,每样接种3瓶,每瓶接种1mL。
于37℃吸附2h后加细胞维持液,封闭、置37℃含5%二氧化碳箱培养,24h后逐日在倒置显微镜下观
察细胞病变,连续观察21d。C.Burnetii 特征性细胞致病效应为HEL 细胞空泡化。无CPE 的盲传
2代。如有CPE,则待70%细胞出现CPE时收毒,将细胞反复冻融2次,3000r/min离心20min,取上
清液4℃保存待鉴定。
8.3 培养物的鉴定
8.3.1 将生长良好的细胞用细胞分散液处理后,制备成2×105 个/mL的细胞悬液,加入24孔细胞培
养板内,每孔3mL,封闭、置37℃二氧化碳培养箱培养。
8.3.2 等细胞生长成80%的单层,吸出孔内培养液,接种8.2待鉴定上清液,每孔3mL,每个样品2个
孔;另外8.2上清液用适量C.Burnetii 阳性血清中和后接种2个孔,每孔3mL;阴性、阳性和空白细胞
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对照方法同待检样品培养物,每个对照2个孔。
8.3.3 置37℃二氧化碳培养箱吸附2h。
8.3.4 吸出各孔内所加的待检和对照样品,加入维持液,每孔3mL,封闭、置37 ℃二氧化碳培养箱培
养10d。
8.3.5 取出细胞板,PBS漂洗,自然干燥后,用-20 ℃预冷的丙酮固定30min,用PBS洗3次,每次
5min,自然干燥。
8.3.6 滴加适量C.Burnetii 阳性血清,置37℃作用1h。
8.3.7 滴加适量C.Burnetii 免疫荧光抗体(二抗),放进湿盒,37℃作用2h。
8.3.8 用PBS洗3次,倾去液体。
8.3.9 荧光显微镜镜检。
8.4 质控标准
阴性对照、空白对照无荧光;阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色,并见有黄绿色荧光的细小颗粒散
布于胞浆内。否则,此次试验视为无效,应重新试验。
8.5 结果判定
8.5.1 没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮,形态清晰,而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光,则
判为阳性。
8.5.2 没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱,形态不清晰,经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光,则
重检。重检后仍荧光微弱,形态不清晰,则判为阳性;重检后无荧光,则判为阴性。
9 聚合酶链式反应(PCR)
9.1 器材
9.1.1 PCR仪。
9.1.2 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
9.1.3 电泳仪和电泳槽。
9.1.4 凝胶成像系统。
9.1.5 Ⅱ级生物安全柜。
9.1.6 微量可调移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格)及其配套的无核酸酶处理的离心管
和吸头。
9.2 试剂
9.2.1 试验用水应符合GB/T6682中的一级水。
9.2.2 组织或粪便基因组DNA 提取试剂盒。
9.2.3 PCR预混液(2×)。
9.2.4 1×TAE缓冲液。
9.2.5 1.5%琼脂糖凝胶。
9.2.6 DNA 分子质量标准(分子大小范围100bp~1000bp)。
9.2.7 空白对照(ddH2O)、阴性对照(取健康动物同类样品)、阳性对照(C.Burnetii 核酸或阳性质粒)。
9.3 引物序列
扩增片段位于C.BurnetiiIS1111基因的保守区域。上游引物Trans1:5'-TATGTATCCACCG
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TAGCCAGTC-3',下游引物Trans2:5'-CCCAACAACACCTCCTTATTC-3',预期扩增片段长度为
686bp(具体序列见附录C中C.1)。
9.4 DNA 提取
9.4.1 将处理好的样品加入1.5mLEP管中,加入600μL 样品裂解液,上下颠倒混匀,混合液置于
55℃ 水浴2.5h。
9.4.2 向匀浆液中按1∶1比例加入DNA 抽提液,轻轻振荡混匀5min,12000g 离心5min。
9.4.3 吸取上层水相800μL 于一灭菌EP 管中,加入等体积DNA 抽提液,轻轻振荡混匀5 min,
12000g 离心5min。
9.4.4 吸取上层水相500μL于一灭菌EP管中,加入2倍体积的无水乙醇,-20℃放置2h。
9.4.5 12000g 离心5min,沉淀DNA,倾去上清液。
9.4.6 于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,轻轻混匀后12000g 离心5min,倾去上清液,室温凉干。
9.4.7 向DNA 沉淀中加TE缓冲液100μL溶解,-20℃保存备用。
9.4.8 每次抽提核酸,应包括一个阳性对照、一个阴性对照和空白对照。
9.4.9 如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存,否则应置于-20℃冷冻保存。
9.4.10 可采用等效的基因组DNA 提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取各类样品中的核酸。
9.5 PCR 检测
9.5.1 PCR 反应体系
进行PCR反应体系配置,检测C.Burnetii 的PCR反应体系见表1。每次进行PCR检测应设立阳
性、阴性和空白对照。加入模板后充分混匀,瞬时离心,使液体沉至PCR管底。
表1 PCR 反应体系
名称加样体积/μL
PCR预混液(2×) 12.5
Trans1(20μmol/L) 0.5
Trans2(20μmol/L) 0.5
模板DNA 2
灭菌双蒸水9.5
反应体系总体积25
9.5.2 PCR 反应条件
PCR反应参数:95℃预变性5min;95℃30s、52℃30s、72℃40s,35个循环;72℃延伸5min。
9.5.3 PCR 扩增产物电泳
制备核酸染料浓度为1.0μg/mL的1.5%琼脂糖凝胶板,在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液,使
液面刚刚没过凝胶。取10μLPCR产物,与2.0μL6×加样缓冲液混合,加入琼脂糖凝胶板的加样孔
中,同时加入DNA 分子质量标准。盖好电泳仪,插上电极,以10V/cm 恒压电泳,至溴酚蓝指示剂迁移
经过凝胶约2/3长度时结束电泳。将凝胶置于凝胶成像系统下观察电泳结果,并做好记录。
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9.6 质控标准
阳性对照扩增出大小为686bp的特异性扩增条带,阴性对照及空白对照无扩增条带。否则,此次
试验视为无效,应重新试验。
9.7 结果判定
在试验成立的条件下,若检测样品有686bp的特异性扩增条带,则初步判定为C.Burnetii 核酸阳
性;被检样品无特异性扩增条带,则判定为C.Burnetii 核酸阴性。检测为核酸阳性的样品,其PCR 产
物进行核酸序列测定,将测序结果与标准参考序列(C.1)进行比对,同源性达96.0% 以上,则判为
C.Burnetii 核酸阳性。
10 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)
10.1 器材
10.1.1 荧光PCR仪。
10.1.2 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
10.1.3 Ⅱ级生物安全柜。
10.1.4 冰箱(2℃~8℃、-20℃、-80℃不同温度)。
10.1.5 微量可调移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格)及其配套的无核酸酶处理的离心
管和吸头。
10.2 试剂
10.2.1 试验用水应符合GB/T6682中的一级水。
10.2.2 组织或粪便基因组DNA 提取试剂盒。
10.2.3 荧光PCR预混液(2×)。
10.2.4 空白对照(ddH2O)、阴性对照(取健康动物同类样品)、阳性对照(C.Burnetii 核酸或阳性
质粒)。
10.3 引物探针序列
扩增片段位于C.Burnetii IS1111 基因的保守区域。上游引物Cox-F:5'-GTCTTAAGGT
GGGCTGCGTG-3',下游引物Cox-R:5'-CCCCGAATCTCATTGATCAGC-3',探针Cox-TM:
5'-FAM-AGCGAACCATTGGTATCGGACGTTTATGG-Eclipse-3',预期扩增片段长度为295bp(具
体序列见C.2)。
10.4 DNA 提取
方法同9.4。
10.5 荧光PCR 检测
10.5.1 荧光PCR 反应体系
进行荧光PCR反应体系配置,检测C.Burnetii 的荧光PCR反应体系见表2。阳性、阴性和空白对
照的设置同9.5.1。加入模板后充分混匀,瞬时离心,使液体沉至PCR管底。
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SN/T1087—2024
表2 荧光PCR 反应体系
名称加样体积/μL
荧光PCR预混液(2×) 12.5
Cox-F(10μmol/L) 2.0
Cox-R(10μmol/L) 2.0
Cox-TM(10μmol/L) 1.2
模板DNA 2
灭菌去离子水5.3
反应体系总体积25
10.5.2 荧光PCR 反应条件
荧光PCR反应参数:95℃预变性30s;95℃5s、59℃35s,40个循环。在每一个循环的59℃收
集FAM 荧光信号。
10.6 结果判定
10.6.1 阈值设定
检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调
整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
10.6.2 质控标准
阴性和空白对照无扩增曲线。阳性对照Ct值<28.0,并出现典型扩增曲线,则视为该试验成立。
否则,此次试验无效,应重新试验。
10.6.3 结果描述及判定
在试验成立的前提下,若检测样品Ct值≤35.0,且出现典型的扩增曲线,则荧光PCR 结果为阳
性,判为C.Burnetii 核酸阳性。若检测样品无Ct值且无扩增曲线,判为C.Burnetii 核酸阴性。若
35.0<ct值<40.0,则样品为可疑,需重新取样进行重复检测,若重复检测的ct值<40.0,且出现典型
的扩增曲线,则判为C.Burnetii 核酸阳性,否则判为阴性。
11 间接免疫荧光试验(IFA)
11.1 材料准备
11.1.1 器材
11.1.1.1 荧光显微镜。
11.1.1.2 保湿培养箱。
11.1.1.3 冲洗盆。
11.1.1.4 微量移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格)。
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11.1.2 试剂
11.1.2.1 IFA 抗原平板诊断板:制备见附录B。
11.1.2.2 FITC标记的兔抗牛(羊)IgG:使用时用含0.01%伊文思蓝的样品稀释液稀释至工作浓度。
11.1.2.3 PBS、甘油缓冲液、1%伊文思蓝染色液、C.Burnetii 阴性和阳性对照血清。
11.2 操作方法
11.2.1 待检血清灭活30min(牛56℃~57℃,绵羊、山羊63℃),然后用PBS做1∶40~1∶640倍比
稀释。
11.2.2 取出事先准备好的抗原诊断板,置室温预温,不要触摸板孔。
11.2.3 每孔滴加20μL稀释度不同的血清,同时做阴性和阳性血清对照,其中一孔滴加20μLPBS作
为抗原对照。
11.2.4 置保湿培养箱37℃30min。反应板用PBS冲洗2次,每次10min。用PBS洗涤,风干。
11.2.5 每孔(包括对照孔)滴加工作浓度的FITC标记的兔抗牛(羊)IgG20μL,于37℃保湿培养箱中
孵育30min。用PBS洗涤3次,风干后立即用荧光显微镜观察。
11.3 试验成立条件
阴性血清对照孔及抗原对照孔无特异性绿色荧光信号,阳性血清对照孔出现规则形状的特异性亮
绿色或黄绿色荧光信号,则试验成立。否则,此次试验无效,应重新试验。
11.4 结果判定
11.4.1 待检血清在1∶160及以上稀释度时,有形状规则的特异性亮绿色或黄绿色荧光信号时,可判
定为Q 热抗体阳性。
11.4.2 待检血清在1∶160及以上稀释度时,没有形状规则的特异性亮绿色或黄绿色荧光信号时,可
判定为Q 热抗体阴性。
12 酶联免疫吸附试验(ELISA)
12.1 材料准备
12.1.1 器材
12.1.1.1 酶标仪。
12.1.1.2 微量酶标反应板。
12.1.1.3 37℃培养箱。
12.1.1.4 保湿盒。
12.1.1.5 冰箱。
12.1.1.6 8道或12道微量移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格)。
12.1.1.7 微量板振荡器。
12.1.1.8 洗板机等。
12.1.2 试剂
12.1.2.1 C.Burnetii 全细胞灭活抗原。
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SN/T1087—2024
12.1.2.2 酶标结合物。
12.1.2.3 10倍浓度的稀释液(吐温/PBS液)。
12.1.2.4 洗涤液。
12.1.2.5 封闭液。
12.1.2.6 双蒸水。
12.1.2.7 四甲基联苯胺(TMB)。
12.1.2.8 双氧水。
12.1.2.9 终止液。
12.1.2.10 阳性及阴性对照血清。
12.2 操作方法
12.2.1 包被抗原:取96孔平底微量反应板,于各孔加工作浓度的全细胞灭活抗原100μL,封板,置保
湿盒内放37℃培养箱中感作60min,再放置4℃冰箱内过夜。
12.2.2 洗板:弃去板中包被液,加洗涤液洗板,每孔300μL,洗涤3次,每次1min,在吸水纸上轻轻
拍干。
12.2.3 封闭:每孔加入封闭液100μL,封板后置室温感作30min~90min。
12.2.4 洗板:方法同12.2.2。
12.2.5 将血清样品(包括对照血清)稀释至适当浓度(通常为1/100),每孔滴加100μL,每个样品加1
孔。对照血清包括阴性、阳性血清,每种对照加2孔。
12.2.6 盖上微量板,置室温感作30min~90min。
12.2.7 洗板:方法同12.2.2。
12.2.8 将酶标结合物稀释至工作浓度,每孔滴加100μL。
12.2.9 盖上微量板,置室温(23℃±5℃)感作30min~90min。
12.2.10 洗板:方法同12.2.2。
12.2.11 每孔加100μLTMB底物溶液,根据产品说明,感作说明书上规定的时间。
12.2.12 加终止液100μL终止氧化物酶反应。
12.2.13 用酶标仪在波长450nm 下测定OD值,并计算结果。
12.3 试验成立条件
阳性对照平均OD值(ODpos)大于0.350。
阳性对照平均OD值和阴性对照平均OD值(ODpos/ODneg)的比值大于3。
12.4 结果判定
计算待测血清以及阳性和阴性对照血清的平均吸光值[待检血清平均OD值(ODs)、阳性血清平均
OD值(ODpos)和阴性血清平均OD值(ODneg)]。按式(1)计算每份血清的S/P(%):
S/P= ODs-ODneg
ODpos-ODneg×100 …………………………(1)
当S/P<30%,判为抗体阴性;当S/P在30%~40%之间,判为可疑,对于可疑血清,需要重新检
验,如重新检验结果仍为30%~40%之间,则判定为抗体阳性;当S/P>40%,判为抗体阳性。
对于市售商品化试剂盒,可根据试剂盒说明书判定。
10
SN/T1087—2024
13 补体结合试验(CF)
13.1 材料准备
13.1.1 器材
13.1.1.1 96孔U 形底反应板。
13.1.1.2 微量板振荡器。
13.1.1.3 37℃培养箱。
13.1.1.4 水浴锅。
13.1.1.5 8道或12道微量移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格)。
13.1.1.6 离心机。
13.1.2 试剂
13.1.2.1 pH7.2巴比妥钙镁缓冲液(VBD)。
13.1.2.2 绵羊红细胞。
13.1.2.3 溶血素。
13.1.2.4 C.Burnetii 抗原。
13.1.2.5 补体。
13.1.2.6 阳性和阴性对照血清。
13.2 预备试验
13.2.1 溶血素效价的测定
13.2.1.1 溶血素的稀释:取溶血素0.1mL加VBD9.9mL混匀,制成100倍稀释的溶血素,再用VBD
把已经100倍稀释的溶血素分别稀释成500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍、
5000倍、6000倍稀释的9种溶液。
13.2.1.2 补体的稀释:用VBD把补体分别稀释成30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍
稀释的8种溶液。
13.2.1.3 致敏红细胞悬液的制备:将不同稀释度(1∶500~1∶6000)的溶血素与等量的2%红细胞悬
液混合,置37℃水浴15min,作为致敏红细胞。
13.2.1.4 溶血素效价的滴定:采用方阵法在微量板上滴定。如表3所示,1~9列为溶血素稀释度
(1∶500~1∶6000),A~H 行为补体稀释度(1∶30~1∶100)。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液
50μL,分别滴加于1~9列的各孔中。吸取不同稀释度的补体50μL分别滴于A~H 行各孔中,每孔再
加25μLVBD,滴加完毕后,置微量振荡器上混匀,随后置37℃温箱中感作30min后进行初判,置室温
2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判。
表3 溶血素效价滴定判定举例表
补体稀释
比例
溶血素稀释比例
1∶500 1∶1000 1∶1500 1∶2000 1∶2500 1∶3000 1∶4000 1∶5000 1∶6000
1∶30 - - - - - - - + +
1∶40 - - - - - - - + +
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表3 溶血素效价滴定判定举例表(续)
补体稀释
比例
溶血素稀释比例
1∶500 1∶1000 1∶1500 1∶2000 1∶2500 1∶3000 1∶4000 1∶5000 1∶6000
1∶50 - - - - - - - + +
1∶60 - - - - - - - + +
1∶70 - - - - - - 90% + ++
1∶80 - - - - - - + + ++
1∶90 - - - + + + + ++ ++
1∶100 - - - + + + ++ ++ ++
注:“++”为50%溶血;“+”为75%溶血;“-”为100%溶血。
13.2.1.5 溶血素效价的判读:对比标准溶血孔(见附录D)进行,在最小量的补体存在下,能使90%红细
胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血素,测定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表
1的测定结果为补体在1∶70稀释时发生90%溶血的最少溶血素为1∶4000,该1∶4000为一个单位
溶血素。两个单位溶血素为1∶2000。
13.2.2 补体效价的测定
13.2.2.1 补体的稀释:用VBD把补体分别稀释成30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍
稀释的8种溶液。
13.2.2.2 使用两个单位溶血素,制备致敏红细胞悬液。
13.2.2.3 补体效价测定:在微量板上1~8列为1∶30~1∶100稀释的补体,各稀释度按表4中定量添
加,再以VBD补充至每孔50μL;接着每孔滴加25μL的抗原后,再滴加50μL2%致敏红细胞悬液,充
分振荡混匀后,置37℃温箱中感作30min后进行初判,然后置室温2h、水平转子离心机2000r/min
离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判。
表4 补体效价测定
补体体积
μL
补体稀释比例
1∶30 1∶40 1∶50 1∶60 1∶70 1∶80 1∶90 1∶100
A 50 50 50 50 50 50 50 50
B 40 40 40 40 40 40 40 40
C 30 30 30 30 30 30 30 30
D 20 20 20 20 20 20 20 20
E 10 10 10 10 10 10 10 10
F 0 0 0 0 0 0 0 0
13.2.2.4 补体效价的判读:对比标准溶血孔(见附录D)进行,取30μL补体呈现90%溶血、20μL补体
呈现75%~90%溶血时补体的最高稀释度作为补体的效价。在正式试验时补体用量为25μL,如表5
的测定结果,1∶70的补体25μL为一个单位补体,试验时用两个单位补体,则1∶35补体25μL为两
个单位补体。
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表5 补体效价判定举例表
补体体积
μL
补体稀释比例
1∶30 1∶40 1∶50 1∶60 1∶70 1∶80 1∶90 1∶100
50 - - - - - - + +
40 - - - - - - + ++
30 - - - - 90% + ++ ++
20 - - - - + + +++ +++
10 - - + ++ +++ +++ ++++ ++++
0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
注:“++++”为0溶血;“+++”为25%溶血;“++”为50%溶血;“+”为75%溶血;“-”为100%溶血。
13.2.3 抗原效价的确认或测定
13.2.3.1 根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需测定,则在确认抗
原效价后按说明稀释使用;如需测定,则按下列步骤进行。
13.2.3.2 用VBD将抗原依次做1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀释。
13.2.3.3 用VBD将阳性血清依次做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释。
13.2.3.4 标准阴性血清不做稀释。
13.2.3.5 按表6建立试验。
表6 抗原测定表
成分及稀释度
抗原稀释度
1∶50 1∶100 1∶200 1∶400
血清对照抗原对照补体对照
红细胞
对照
抗原25 25 25 25 0 25 0 0
阳性
血清/
μL
1∶10 25 25 25 25 25 0 0 0
1∶20 25 25 25 25 25 0 0 0
1∶40 25 25 25 25 25 0 0 0
1∶80 25 25 25 25 25 0 0 0
1∶10阴性血清/μL 25 25 25 25 25 0 0 0
2单位补体/μL 25 25 25 25 25 25 25 0
VBD/μL 0 0 0 0 0 25 50 75
4℃感作12h~18h后置室温10min
致敏红细胞/μL 50 50 50 50 50 50 50 50
37℃感作30min后进行初判,然后置室温2h,水平转子离心机2000r/min离心5min,或4℃冰箱过夜后进行最终
判定
13.2.3.6 抗原效价的判读:对比标准溶血孔(见附录D)进行,当血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔
出现100%溶血,而红细胞对照孔不出现溶血且红细胞全部沉于孔底时,判定抗原效价。以与阳性血清
各稀释度发生完全抑制溶血的最高稀释度为一个单位抗原,正式试验使用两个单位抗原。
13
SN/T1087—2024
13.3 正式试验
标准阳性血清和标准阴性血清使用前用VBD做1∶10稀释,56℃水浴灭活30min;待检血清使用
前用VBD做1∶10稀释,灭活30min(牛56℃~57℃,绵羊、山羊63℃)。按表7建立正式试验。
表7 补体结合试验正式试验操作表
成分及稀释度
待检血清
试验孔对照孔
阳性血清阴性血清抗原对照补体对照红细胞对照
1∶10待检血清/μL 25 25 0 0 0 0 0
1∶10阳性血清/μL 0 0 25 0 0 0 0
1∶10阴性血清/μL 0 0 0 25 0 0 0
两个单位抗原/μL 25 0 25 25 25 0 0
两个单位补体/μL 25 25 25 25 25 25 0
VBD/μL 0 25 0 0 25 50 75
4℃感作12h~18h后置室温10min
致敏红细胞/μL 50 50 50 50 50 50 50
37℃感作30min后进行初判,然后置室温2h,水平转子离心机2000r/min离心5min,或4℃冰箱过夜后进行最终
判定
13.4 试验成立条件
当红细胞对照孔不溶血,阳性血清孔出现100%抑制溶血,阴性血清对照孔、抗原对照孔、补体对照
孔及待检血清对照孔均出现100%溶血时,试验成立。否则,此次试验视为无效,应重新试验。
13.5 结果判定
13.5.1 对比标准溶血孔(见附录D),对待检血清管进行判定,并做如下记录:
++++表示90%以上抑制溶血;+++表示75%以上抑制溶血;++表示50%以上抑制溶
血;+表示25%以上抑制溶血;-表示100%溶血。
13.5.2 判定标准:待检血清1∶10稀释时小于50%抑制溶血,判为Q 热抗体阴性,否则判为Q 热抗体
阳性。在进出境动物的检疫中,对判定标准有规定的按规定执行。
14 综合判定
14.1 临床有疑似症状的易感动物,经分离出C.Burnetii、PCR或实时荧光PCR中任一方法对C.Burnetii
检测结果为阳性的,判定为Q 热。
14.2 临床无明显特异性症状的易感动物,经PCR、实时荧光PCR中任一方法对C.Burnetii 检测结果
为阳性的,判定为C.Burnetii 感染。
14.3 临床无明显特异性症状的易感动物,经间接免疫荧光试验、ELISA、补体结合试验中任一方法检
测出抗体阳性的,判定为Q 热抗体阳性。
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SN/T1087—2024
附 录 A
(资料性)
Q 热概述
A.1 病原学
Q 热病原体为贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii,C.Burnetii),是一种人兽共患病病原,革兰氏阴性
专性胞内寄生菌,能在吞噬细胞的吞噬溶酶体内旺盛生长。C.Burnetii 过去被分类为立克次体科,但是
基于16srRNA 序列的基因进化分析表明其同立克次体属进化关系较远,目前将其归入军团菌目、柯克
斯体属、柯克斯体科。C.Burnetii 存在抗原相变异现象。从感染动物或人分离的Ⅰ相菌株具有致病
性,是天然相;Ⅰ相菌株经鸡胚卵黄囊连续传代或细胞培养,变为Ⅱ相菌株,毒力减弱。Ⅰ相与Ⅱ相的抗
原变异实质是菌体LPS抗原性变异。Ⅰ相菌体LPS具有全长O 链,但是O 链变短后成为Ⅱ相菌体。
因此,Ⅰ相菌体LPS包含Ⅱ相菌体LPS,同时Ⅱ相菌体LPS是主要的抗原决定簇。目前针对Q 热抗体
检测的商业化试剂盒主要检测抗C.Burnetii Ⅱ相抗体。
C.Burnetii 多为短杆状,偶尔呈球状、双杆状、新月状或丝状等多形体,大小一般为(0.2μm~
0.4μm)×(0.4μm~1.0μm),常成对排列。无鞭毛,无荚膜,可形成芽孢。通过氯化铯梯度密度离心可
将细胞内繁殖的本菌分离出两种细胞型菌体,上层密度低的细胞较小(SCV),稠密,成棒状,胞壁明
显,核质紧密;下层密度大的细胞较大(LCV),圆形,多形性明显,颗粒状,核质松散。不能在人工培养
基上生长,通常用鸡胚或细胞培养。鸡胚卵黄囊在接种后第4天产生较多菌体,第5~7天达到高峰,以
卵黄囊膜中含菌量最多。多种原代或传代细胞可用于培养本菌,通常不引起明显的细胞病变。
C.Burnetii 对理化因素抵抗力较强,在环境中可存活数年。对干燥的耐力强,在感染动物和蜱干燥
的排泄物和分泌物及蜱组织中可长期存活。干燥羊毛及未经氯化处理的水中4℃下,可存活1年以上。
在肉类中,至少1个月不丧失毒力。C.Burnetii 无需经节肢动物而通过气溶胶即可感染人类,并能大规
模生产和贮存。
A.2 流行病学
Q 热是由贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii,C.Burnetii)引起的一种人兽共患传染病,于1935年在
澳大利亚被首次发现,目前存在于除新西兰以外的世界各国。Q 热的传染源主要是家畜,特别是牛、
羊,其次是马、骡、犬以及野生啮齿动物,飞禽及爬虫类动物。在自然疫源地动物中,有90多种野生哺乳
动物和70多种野鸟可自然感染;在经济疫源地或家居环境(家居型循环)的宿主动物主要是黄牛、水牛、
奶牛、绵羊和山羊、马等,猫、犬、家兔、鸟等也参与Q 热的传播循环,尤其牛、羊是人感染的主要传染源。
动物主要经消化道、呼吸道传播,也可经垂直传播和性传播,蜱、螨等节肢动物是重要传播媒介。Q
热传播也与感染动物咬伤及其干燥粪便污染的灰尘有关。人感染Q 热主要是通过吸入干燥的气溶胶
颗粒、接触感染动物及其生殖组织,以及接触羊毛等动物产品造成,也可经食用以污染了C.Burnetii 的
原料奶制成的奶制品而摄入感染。Q 热可在动物体内持续感染,经奶、粪便、尿排出病原,有时血液带
菌。病原大量存在于生殖排出物(胎盘、羊水和胎儿),未孕动物传播风险较低。该病发生没有明显的季
节性,全年均可发生,但牧民发病主要出现在家畜产仔期的春季。
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SN/T1087—2024
附 录 B
(规范性)
试剂配制
B.1 细胞培养液
MEM 培养基,加入10%无C.Burnetii 抗体犊牛血清(56 ℃ 30min灭活),含青霉素200IU/μL、
链霉素200IU/μL,抽滤除菌,置4℃保存备用。
B.2 细胞维持液
MEM 培养基,加入2%无C.Burnetii 抗体胎牛血清(56℃30min灭活),含青霉素200IU/μL、链
霉素200IU/μL,抽滤除菌,置4℃保存备用。
B.3 细胞分散液
胰酶 2.50g
乙二胺四乙酸二钠 0.20g
无钙镁离子PBS 1000mL
混匀抽滤除菌,置4℃保存备用。
B.4 0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)
Na2HPO4·12H2O 2 .9 g
KH2PO4 0 .2 g
NaCl 8 .0g
KCl 0.2 g
加双蒸水至1000mL,调pH 为7.4,121℃高压灭菌20min,4℃保存。
B.5 姬姆萨染色液
姬姆萨粉 0 .3g
甘油 2 5mL
甲醇 2 5mL
先将姬姆萨粉与甘油混匀,60℃保温溶解2h,再加入甲醇混匀,过滤即配成姬姆萨色素原液,应用
前用PBS(pH6.8)做1∶10稀释。
B.6 50×TAE电泳缓冲液
B.6.1 0.5mol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(pH8.0)
称取二水乙二胺四乙酸钠1.44g,使用80mL双蒸水充分溶解,使用氢氧化钠溶液调pH 至8.0,加
双蒸水至100mL,室温保存。
B.6.2 TAE电泳缓冲液(50×)
羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸 57.1mL
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SN/T1087—2024
0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0) 100mL
加双蒸水至1000mL,室温保存。
B.6.3 TAE电泳缓冲液(1×)
使用前将50×TAE电泳缓冲液做50倍稀释即可。
B.6.4 1.5%琼脂糖凝胶
称取琼脂糖1.5g,使用1×TAE 电泳缓冲液100 mL 充分溶解,微波炉中完全融化,待冷却至
50℃~60℃时,加入核酸染料溶液5μL,摇匀,倒入电泳板,凝固后取下梳子,备用。
B.7 包被缓冲液(0.05mol/L,pH7.4)
Na2CO3 1 .59g
NaHCO3 2.93g
去离子水 1 000mL
B.8 洗涤缓冲液
0.01mol/LpH7.4PBS 1 000mL
吐温-20 0 .5mL
B.9 样品稀释液
含1%牛白蛋白的PBS
B.10 底物溶液
柠檬酸 4 6.5mg
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 184.3mg
邻苯二胺(OPD) 4.0mg
30%H2O2 2.0μL
去离子水 至10mL
B.11 终止液(2mol/L硫酸)
H2SO4 58mL
去离子水 4 42mL
B.12 样品裂解液
10mmol/LTris(pH7.4),10 mmol/LEDTA,150 mmol/L NaCl,0.4% SDS,100μg/mL 蛋白
酶K。
B.13 DNA 抽提液
苯酚、三氯甲烷、异戊醇按25∶24∶1混匀即可。
B.14 TE缓冲液
10mmol/LTris、1.0mmol/LK2EDTA 混匀,调pH 至8.0。
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SN/T1087—2024
B.15 IFA 诊断板
用细胞分散液消化人胚肺成纤维细胞(HEL),用细胞营养液稀释成5×104 个/mL,C.Burnetii 标
准株,加到96孔细胞培养板的1、2、4、5、7、8、10、11列孔内,每孔100μL。将细胞培养板置37℃5%二
氧化碳恒温培养箱中培养10d,弃去培养液,每孔加入预冷的丙酮100μL,将此细胞培养板置于
-20℃冰箱备用。
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SN/T1087—2024
附 录 C
(资料性)
参考序列
C.1 贝氏柯克斯体IS1111基因PCR 产物序列(686bp)
TATGTATCCACCGTAGCCAGTCTTAAGGTGGGCTGCGTGGTGATGGAAGCGTGTGGAG
GAGCGAACCATTGGTATCGGACGTTTATGGGGATGGGTATCCCAACGCAGTTGATCAGTCC
GCAGCACGTCAAACCGTATGTCAAAAGTAACAAGAATGATCGTAACGATGCGCAGGCGAT
AGCTGAAGCGGCTTCCCGCGCCTCGATGCGGTTTGTGCAGGGTAAAACGGTGGAACAACAA
GACGTTCAAGCGCTGTTAAAGATACGCGATCGTTTAGTCAAAAGCCGCACGGCGCTGATCA
ATGAGATTCGGGGGTTGTTGCAAGAATACGGACTCACGATGGCGCGTGGTGCCAAGCGAT
TTTATGAAGAGCTCCCGTTGATTTTAGCGAGCGAAGCGGTGGGATTAACACCGCGGATGA
AACGGGTGTTGAATTGTTTGTATACCGAATTGTTGAACCGGGACGAAGCGATTGGTGATT
ACGAGGAGGAATTAAAAGCGGTGGCAAAAGCCAATGAGGATTGTCAACGGGTACAGAGCA
TCCCGGGGGTGGGTTATTTAACGGCGCTCTCGGTTTATGCGAGCGTGGGTGACATTCATCA
ATTTCATCGTTCCCGGCAGTTGTCGGCGTTTATTGGGTTGGTCCCTCGACAACATTCGAGT
GGGAATAAGGAGGTGTTGTTGGG
C.2 贝氏柯克斯体IS1111基因荧光PCR 产物序列(295bp)
GTCTTAAGGTGGGCTGCGTGGTGATGGAAGCGTGTGGAGGAGCGAACCATTGGTATC
GGACGTTTATGGGGATGGGTATCCCAACGCAGTTGATCAGTCCGCAGCACGTCAAACCGTA
TGTCAAAAGTAACAAGAATGATCGTAACGATGCGCAGGCGATAGCTGAAGCGGCTTCCCG
CGCCTCGATGCGGTTTGTGCAGGGTAAAACGGTGGAACAACAAGACGTTCAAGCGCTGTTA
AAGATACGCGATCGTTTAGTCAAAAGCCGCACGGCGCTGATCAATGAGATTCGGGG
19
SN/T1087—2024
附 录 D
(规范性)
标准溶血孔配制
D.1 血红蛋白溶液的制备:取2%绵羊红细胞悬液1.0mL,加入装有7.0mL蒸馏水的试管内,充分振
荡,使红细胞全部裂解,再加入2.0mLVBD,充分混合。
D.2 0.2%绵羊红细胞悬液的制备:取2%绵羊红细胞悬液1.0mL,加入VBD9.0mL。
D.3 按表D.1配制不同溶血度的标准溶血管,并充分振荡混匀。
表D.1 标准溶血管配制表
成分
溶血度
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
血红蛋白溶液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
0.2%绵羊红细胞悬液/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
D.4 从标准溶血管配制表的各管中分别取125μL加入微量板的对应孔,轻摇混匀后静置,待红细胞全
部沉淀于孔底后用于试验判读的对照。
20
SN/T1087—2024</ct值<40.0,则样品为可疑,需重新取样进行重复检测,若重复检测的ct值<40.0,且出现典型