ICS 71.100.40 CCS Y43
团 体 标 准
T/CHCIA 008—2022
洗手产品除病毒效果的离体试验方法
In-vitro Test Method for Evaluation of Virus Removal Efficacy of Hand-wash Formulations
2022- 12-20发布 2023-01-20实施
中国日用化工协会 发 布
T/CHCIA 008—2022
目 次
T/CHCIA 008—2022
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。
本文件由中国日用化工协会提出。
本文件由中国日用化工协会归口。
本文件起草单位：广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、中轻日用化学 检验认证有限公司、北京绿伞科技股份有限公司。
本文件主要起草人：孙廷丽、谢小保、周少璐、余树岚、黎玉莲、文霞、黄健聪、陈嘉乐、王 永祥、邝荣康、徐碧霞、公培龙、王杰。
T/CHCIA 008—2022
洗手产品除病毒效果的离体试验方法
1 范围
本文件规定了洗手产品除病毒效果的离体试验方法。
本文件适用于洗手产品除病毒性能的测试。
本文件不适用于免洗类洗手产品。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。
GB5749 生活饮用水卫生标准
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
YY 0569 Ⅱ级生物安全柜
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
病毒 viurs
没有细胞结构、只能在宿主细胞内进行复制的微生物或遗传单元，通常由蛋白质和一种类型的 核酸 (DNA或RNA) 组成。
3.2
噬菌体 bacteriophage
以细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物为侵染宿主的病毒的总称。
3.3
除病毒 virus removal
采用物理、化学等方法抑制及去除载体表面附着的病毒的综合作用。
3.4
洗手产品 handwash formulations
日常使用的包含或不包含消毒剂、经洗手过程使用、用以清洁或去除手部污染物的产品总称。 3.5
洗手 hand wash
指用洗手产品和流动水洗手，通过搓洗和冲洗去除载体表面污染物的过程。 3.6
载体 carrier
试验病毒的支持物。
3.7
病毒去除率 virus removal efficacy
使用洗手产品前后病毒含量减少的百分率或对数值。
4 警告
使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验，本文件并未指出所有可能的安全问题，使 用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。试验需在符合微生 物相应安全等级的实验室内进行。
工
5 实验原理
文件中采用噬菌体作为人病毒的替代病毒，使用离体仿真皮作为试验载体，通过模拟洗手过程， 建立的离体试验方法。具体的，将离体仿真皮裁剪到一定大小，人工污染一定含量的病毒悬液，采 用洗手产品进行模拟洗手的过程，清洗后进行回收计数，比较使用洗手产品后相对仅使用自来水洗 手后病毒的数量，得到产品对病毒去除有效性的结论，并通过比较使用洗手产品前后病毒的数量的 减少情况，得到病毒的去除率。
6 仪器设备
6.1 恒温培养箱
控温范围：5℃~50℃,温度精度1℃。
6.2 干热灭菌箱
控温范围：50℃~200℃,温度精度2℃。
6.3 离心机
控速范围：500 r/min～10000 r/min, 转速精度1%。
6.4 生物安全柜
应为符合YY 0569规定的IⅡ级生物安全柜。
6.5 恒温摇床
控温范围：5℃~50℃,旋转频率： 20 r/min～300 r/min。
6.6 显微镜
普通光学显微镜。
6.7 冰 箱
控温范围：2℃~8℃,-70℃~-80℃。
6.8 可调移液器
量程：1μL～10μL 、10μL～100μL 、100μL～1000 μL 、1mL～5mL, 配备适用的吸头。
6.9 水浴锅
控温范围：45℃~55℃。
6.10 均质器
6.11 密封袋
6.12 培养皿、试管、量筒等其它微生物学试验用具及耗材 微生物培养和实验的各个规格。
7 试剂和材料
7.1 病毒和宿主
采用以下两类噬菌体作为测试病毒：
a) φX174(ATCC 13706-B1), 宿主：大肠杆菌(Escherichia coli,ATCC 13706) , 或 MS2(ATCC 15597-B1), 宿主：大肠杆菌 (Escherichia coli,ATCC 13706 、ATCC 15597) 作为无包膜病 毒的替代病毒;
b) φ 6(NBRC 105899),宿主：丁香假单胞菌 ( Pesduomonas syringe , NBRC 14084),作为包膜 病毒的替代病毒。
注1: 可以使用加入世界菌种保藏联合会 (WFCC) 的菌种保藏机构提供的与上述菌毒种等效的试验菌毒株。
注2: 根据需要，可以使用一种或多种噬菌体作为试验病毒，也可增选其它具有指示作用的噬菌体。
注3: 噬菌体及宿主的培养计数条件可根据菌毒种的特性在实验室验证后进行改变。
7.2 培养基和试剂
7.2.1 通则
所用的试剂和材料应是适用于生物学试验的。实验室可以按照实际情况选用，允许使用验证合 格的其它配方，推荐使用商品化试剂及耗材，并按照生产商提供的说明书使用。如果是特殊菌毒种， 可以使用菌毒种保藏中心或文献中规定的其它培养基及其配方。
所用的水应为符合GB/T6682规定的三级水。
7.2.2 底层营养琼脂培养基
蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂
水
10g 5g 5g 15g
1000 mL
除琼脂外其它成份溶解于水中，调pH 至7.2～7.4,加入琼脂，加热溶解，分装，于121℃压 力蒸汽灭菌20 min备用。
7.2.3 上层营养琼脂培养基
除琼脂外其它成份溶解于水中，调pH 至7.2～7.4,加入琼脂，加热溶解，分装，于121℃压 力蒸汽灭菌20 min备用。
7.2.4 营养肉汤培养基
蛋白胨 牛肉膏 氯化钠
水
将各成分溶解于水中，调pH 7.3 磷酸盐缓冲液 (PBS,pH
无水磷酸氢二钠
10g
5g
5g
1000 mL
至7.2～7.4,分装，于121 ℃ 压力蒸汽灭菌20 min备用。
7.2～7.4)
2.83g
磷酸二氢钾 1.36g
水加至 1000 mL
将各成分加入到水中，待完全溶解后，调pH 至7.2～7.4,于121℃压力蒸汽灭菌20 min备 用。
7.40.1%蛋白胨生理盐水
蛋白胨 1g
氯化钠 8.5g
水 1000 mL
将各成分溶解于水中，调 pH 至7.2～7.4,分装，于121℃压力蒸汽灭菌20 min 备用。
注：试验中可以根据洗手产品本身添加的杀菌/病毒剂成分，选择合适的具有中和作用的回收稀释液。
7.5 载体
离体仿真皮。
注：可以使用VITRO-SKIN(IMS) 。 本 文件给出这种仿真皮的目的仅为文件的使用者提供便利和参考，并不为 产品背书。文件允许使用其它相似功能的产品作为试验载体。
8 试验过程
8.1 病毒悬液及宿主的制备
8.1.1 病毒悬液的制备
宿主菌活化后挑取典型菌落接种到10mL营养肉汤培养基中，大肠杆菌置(36±2)℃、丁香假 单胞菌置(28±2)℃, (150±15) r/min 振荡培养16h~20h; 取1mL菌悬液接种到100 mL 肉汤 培养基中，按上述温度条件振荡培养(4±0.5)h, 接 种 1mL噬菌体母液(或冻干粉),剧烈振荡， 培养18h~24h 。 加入2mL氯仿，剧烈振荡10 min, 将培养液分装至合适的离心管中， (8000±800) r/min离心5 min～10 min, 取上清液，用0.22 μm 孔径的薄膜过滤得到噬菌体悬液。测噬菌体效价后 存放室温或2℃~8℃冰箱备用，需长期保存的噬菌体放置在-70℃~-80℃。
注：也可以使用等效方法提取制备病毒悬液。
8.1.2 宿主菌悬液制备
取活化两次的菌种，用PBS培养基洗脱得到菌悬液，一般制备的菌悬液浓度为10⁸cfu/mL～10⁹ cfu/mL。
8.2 试验载体的准备
无菌条件下打开仿真皮包装，将仿真皮剪成8cm×10cm 大小，试验面向上备用。每个试验中准 备15片裁好的仿真皮试样，5片用基线回收取样(即接种后立即洗脱病毒取样),5片用自来水清洗 后作为对照组试样;5片用作洗手产品洗手试验样。试验前用水润湿仿真皮表面，纸巾轻拍干燥。
8.3 试验病毒的接种
噬菌体悬液稀释至约3×10⁹pfu/mL～8×10⁹pfu/mL, 取0.5mL噬菌体悬液加到仿真皮表面，涂布 棒涂抹均匀至皮表面干燥。
注：试验中可以根据仿真皮对接种液的吸收情况改变接种体积，但需保证每片仿真皮表面接种量不小于10⁸pfu/ 片。
8.4 基线回收
8.4.1 干燥后的5片仿真皮分别放入均质袋或样品瓶中，加入PBS 缓冲液20mL, 均质器标准强度 快速拍打2min, 或剧烈摇动样品瓶1min, 获得病毒洗脱液;
8.4.2 密封袋(均质袋)或样品瓶中取1mL洗脱液，进行10倍梯度稀释，取合适梯度，分别与1mL 宿主菌混合，加入5mL上层营养琼脂培养基，充分混匀后平铺于事先倒好的底层营养琼脂培养基平 板中，待凝固后置于恒温培养箱中，培养12h～16h, 点数平皿上的噬菌斑数量。每个梯度做两个 平行。
8.5 测试样品清洗过程
8.5.1 调节水流速至约(4.0±0.3)L/min。洗手试验用的水为市政自来水，其水质要求符合GB5749 的卫生要求。
注：可用室温水，水温宜控制在(35±2)℃。
8.5.2 轻轻打湿染噬菌体的仿真皮，然后按下列方式进行清洗：
1) 以自来水清洗作为对照试验组，搓洗30s, 流水冲洗30s;
2) 对于固体类产品(如香皂),使用产品擦15s, 整手掌部分搓洗起泡30s, 流水冲洗 30s;
3) 对于液体类产品(如洗手液),称取0.45g 样品至皮表面，整手掌部分搓洗起泡30s, 流水冲洗30 s;
注：洗手方式中产品用量及搓洗时间等也可以由各相关方协商决定，但需要在报告中说明。
8.5.3 冲洗完毕，使用无菌纸巾轻轻拍干皮表面。
8.6 病毒的回收及计数
冲洗完毕后，将仿真皮置于密封袋(均质袋)或样品瓶内，加入合适体积的回收液进行洗脱， 计数。洗脱及计数方法见8.4。洗后回收稀释液可以选用0.1%蛋白胨生理盐水或者其它经过证实的 带中和作用的回收液，不含杀病毒及杀菌成分的可以直接使用 PBS 缓冲液。
9 结果计算与评价
9.1 病毒回收计数结果 按公式(1)进行计算：
式中：
N——每片仿真皮试样回收病毒数，pfu/片;
N₁、N₂——平行平皿上的噬菌斑数，pfu/mL;
P——稀释倍数;
V——每片仿真皮试样洗脱液的体积，mL/片。
9.2 质量控制
实验结果应满足如下要求，否则试验无效：
a) 每片仿真皮基线回收病毒数N 按公式(1)进行计算，不少于10⁷pfu/片;
b) 5 片平行仿真皮基线回收病毒数N的对数值须满足公式(2):
… ……(2)
式中：
lgNoMax ——5片仿真皮基线回收病毒数的最大对数值;
IgNoMin——5片仿真皮基线回收病毒数的最小对数值;
IgNoMean—5 片仿真皮基线回收病毒数的平均对数值;
9.3 病毒去除效果的计算与评价
9.3.1 去除效果有效性
T/CHCIA 008—2022
对依照公式(1)计算获得的5片对照组回收病毒数 ( Nc) 的对数值 (lgNc) 与5片试验组回收病 毒数 ( M₆) 的对数值 (lgN₆) 进行t检验，显著性水平取p≤0.05 ( 双尾检验),评价测试样品与对照 样品除病毒性能是否存在差异，给出结论。当两组样品结果存在显著性差异，且5片对照组回收病毒 数的平均对数值 (lgNc Mean) 大于5片试验组回收病毒数的平均对数值 (lgNoMean) 时，可认为试验组 样品具有除病毒效果，进一步计算其病毒去除率。
9.3.2 病毒去除率的计算
a) 对数去除值
按公式(3)进行计算
Rn=1gNoMean-1gNbMean ……… … …(3)
式中：
Rɴ——病毒的对数去除值(保留至小数点后两位);
lgNoMean—5 片仿真皮基线回收病毒数的平均对数值;
IgN6Mean——5 片试验组仿真皮回收病毒数的平均对数值。
b) 病毒百分去除率
按公式(4)进行计算
式中：
R——病毒的百分去除率(保留至小数点后两位),%;
No Mean——5片仿真皮基线回收病毒数的平均值，pfu/片;
NbMean——5片试验组仿真皮回收病毒数的平均值，pfu/片。
10 报告
测试报告需包含以下信息：
a) 注明使用本文件;
b) 样品信息;
c) 测试病毒详细信息;
d) 每次试验中各组别每片离体仿真皮上回收到的病毒的数量;
e) 试验的有效性;
f) t 检验结果;
g) 病毒去除率;
h) 任何对本文件的偏离。
评论