YY/T 1985-2025 组织工程医疗器械 胶原蛋白

　　ICS11.030.30

CCS C30

中华人民共和国医药行业标准

YY/T1985—2025

组织工程医疗器械 胶原蛋白

Tissueengineeredmedicaldevices—Collagen

2025-09-15发布2026-10-01实施

国家药品监督管理局发布

目 次

前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ

引言………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ

1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1

2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1

3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1

4 工艺质量控制…………………………………………………………………………………………… 2

5 检测指标、要求及检测方法……………………………………………………………………………… 2

6 生物学评价……………………………………………………………………………………………… 8

7 原材料外源因子污染的风险控制……………………………………………………………………… 8

8 存储条件/货架期稳定性………………………………………………………………………………… 9

9 包装、运输………………………………………………………………………………………………… 9

附录A(规范性) 胶原蛋白高级结构分析……………………………………………………………… 10

附录B(规范性) Ⅰ型胶原蛋白纯度测定……………………………………………………………… 13

附录C(规范性) 羟脯氨酸含量测定…………………………………………………………………… 15

附录D(规范性) 胶原蛋白分子量测定———分子排阻色谱法………………………………………… 18

附录E(规范性) 色氨酸含量的测定…………………………………………………………………… 20

附录F(规范性) 变性胶原蛋白检测———蛋白酶酶解法……………………………………………… 22

附录G(规范性) 细胞黏附性测定———离心法………………………………………………………… 27

附录H(规范性) 胶原蛋白自组装性能测试方法……………………………………………………… 30

附录I(规范性) 弹性蛋白含量检测———液相色谱-质谱法…………………………………………… 32

附录J(规范性) 总糖含量测定………………………………………………………………………… 35

参考文献…………………………………………………………………………………………………… 37

Ⅰ

YY/T1985—2025

前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由国家药品监督管理局提出。

本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会

(SAC/TC110/SC3)归口。

本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、中国科学院过程工程研究所、四川省药品检验研究院

(四川省医疗器械检测中心)、广州创尔生物技术股份有限公司、河北考力森生物科技有限公司、无锡贝

迪生物工程股份有限公司、中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国科学院理化技术研究所、中国医

学科学院生物医学工程研究所、四川大学轻工科学与工程学院、浙江珂瑞康生物医疗科技有限公司。

本文件主要起草人:陈亮、柯林楠、张贵锋、刘兴兰、李国英、邵明非、赵燕南、张其清、叶春婷、

程咏梅、刘国保、徐松成、付步芳、黄元礼、高建萍、邢芳毓、王晓亮、兰婉玲、罗思施、李奕恒、陆金婷、

陈丽媛、戴建武、郭燕川、徐丽明。

Ⅲ

YY/T1985—2025

引 言

胶原蛋白是细胞外基质的主要蛋白,也是与机体的细胞、组织和器官功能紧密相关的功能性蛋

白,具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性。随着人们对胶原蛋白结构和功能等研究的不

断深入,胶原蛋白在医疗领域的应用日益广泛,包括止血海绵、敷料、软组织填充注射剂、组织工程医疗

器械产品、细胞基产品的基质以及药物递送的载体。

同时,组织提取胶原蛋白的理化性能、生物学、免疫学或毒理学特性可能因来源和提取工艺而异。

因为尚未完全了解胶原蛋白性质随来源材料和提取工艺的变化,因此需要充分研究不同来源和工艺制

备的胶原蛋白的性质,并通过进行特定表征来比较不同的胶原蛋白。

虽然胶原蛋白具有多功能性而在医疗领域中广泛应用,但是胶原蛋白的实际应用需要基于材料的

生物相容性和预期特定应用的功能性指标(包括物理、化学和生物学检测与评价的数据)进行设计开发。

因此,规范要求胶原蛋白质量和安全性相关的性能指标和建立相应的检测评价方法,这对于胶原蛋白研

发生产、质量控制、检测评价以及技术审评都具有重要意义。

Ⅳ

YY/T1985—2025

组织工程医疗器械 胶原蛋白

1 范围

本文件规定了组织提取胶原蛋白的工艺控制、检测指标、生物学评价等要求,描述了相应的检测

方法。

本 文件适用于组织工程医疗器械用胶原蛋白的表征和质量评价。

注1:本文件所列出的检测指标和要求主要基于纯化的Ⅰ型胶原蛋白考虑,并不一定适用于全部胶原类型。

注2:其他医疗器械用胶原蛋白的表征和质量评价参考本文件。

注3:由培养细胞提取的胶原蛋白参考本文件进行胶原蛋白的表征,宜基于风险分析进行质量控制。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文

件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于

本文件。

GB5009.6 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T16886.1 医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验

GB/T16886.10 医疗器械生物学评价 第10部分:刺激与皮肤致敏试验

GB/T16886.20 医疗器械生物学评价 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则和方法

GB/T44353.1 动物源医疗器械 第1部分:风险管理应用

GB/T44353.2 动物源医疗器械 第2部分:来源、收集与处置的控制

YY/T0771.3 动物源医疗器械 第3部分:病毒和传播性海绵状脑病(TSE)因子去除与灭活的

确认

YY/T0771.4 动物源医疗器械 第4部分:传播性海绵状脑病(TSE)因子的去除和/或灭活及其

过程确认分析的原则

YY/T1511—2017 胶原蛋白海绵

YY/T1805.2 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第2部分:Ⅰ型胶原蛋白分子量检测 十二

烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法

YY/T1805.3 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第3部分:基于特征多肽测定的胶原蛋白含

量检测 液相色谱-质谱法

YY/T1849—2022 重组胶原蛋白

YY/T1955 组织工程医疗器械 胶原蛋白 术语

中华人民共和国药典

3 术语和定义

YY/T1955界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

1

YY/T1985—2025

3.1

胶原蛋白特征多肽 collagenmarkerpeptide

在不同来源及不同类型的胶原蛋白序列进行Blast多序列比对中,只在某一特定来源和/或特定类

型的胶原蛋白序列中出现的,化学修饰或交联对其丰度没有影响,在色谱分离过程中有较高的分离度的

肽段。

4 工艺质量控制

宜根据组织来源的特点和影响所提取胶原蛋白性能和质量的风险分析,建立完善的质量控制体

系,包括但不限于以下方面:基本要求(生产及检定用设施、动物组织等生产用原材料及辅料、生产用水

和器具等),生产过程的控制(原料预处理、半成品、成品、分装、病毒去除与灭活等)以及生产工艺变更要

求,建立质量控制体系,不适用条款或事项需给出合理的说明。

5 检测指标、要求及检测方法

5.1 一般理化性质指标

5.1.1 外观(如性状、颜色)

肉眼直接观测,供试品应为半透明白色/半透明淡黄色/无色透明液体,或白色/类白色粉末,或白

色/类白色海绵状固体。

5.1.2 可见异物

适用时,按照《中华人民共和国药典》“可见异物检查法”的“灯检法”进行检测,供试品应无肉眼可见

异物。

5.1.3 溶解性

应根据供试品的溶解特性,对供试品在不同溶剂中的溶解程度和条件进行表征和阐述,包括但不限

于溶解时的溶剂种类、pH、浓度、时间、温度等条件。

5.1.4 pH

胶原蛋白液体直接取供试品,按每毫克纯化水加入0.5mg~1mg胶原蛋白固体的比例,在37℃下

浸提24h制备供试品,按照《中华人民共和国药典》“pH 值测定法”测定,供试品pH 应符合所标示

范围。

5.1.5 水分

取胶原蛋白固体0.5g~2g,按照《中华人民共和国药典》“干燥失重测定法”测定,供试品减失重量

应符合所标示范围。

5.1.6 炽灼残渣

按照《中华人民共和国药典》“炽灼残渣检查法”测定,供试品炽灼残渣应符合所标示范围。

5.2 胶原蛋白的特性指标

5.2.1 胶原蛋白鉴别

5.2.1.1 红外分光光度法、拉曼光谱法、特征多肽测定法、免疫印迹法、酶联免疫法等可用于胶原蛋白鉴

2

YY/T1985—2025

别,宜选择一种或多种方法进行胶原蛋白来源动物种属和/或型别的鉴别。也可选择其他经验证的方法

进行胶原蛋白的鉴别。

5.2.1.2 红外分光光度法:取供试品适量,按照《中华人民共和国药典》“红外分光光度法”测定,Ⅰ型胶

原蛋白应具有图1 所示的红外光谱特征峰:3488cm-1 ~3188cm-1、3102cm-1 ~3062cm-1、

2985cm-1~2915cm-1、1667cm-1~1627cm-1,1548cm-1、1452cm-1、1402cm-1、1338cm-1、

1238cm-1。未给出范围的波数值,实测谱带的波数误差应小于规定值的±0.5%。

5.2.1.3 拉曼光谱法:取供试品适量,按照《中华人民共和国药典》“拉曼光谱法”测定,典型测试条件为

选择50倍以上显微镜物镜观察,并精确对焦,激光光源可使用532nm 激光光源(功率50 mW)或

633nm 激光光源(功率17mW),选择100%功率模式;选择合适的光栅系统,实现5cm-1的扫描分辨

率,选择600cm-1~1800cm-1特征拉曼位移区间作为扫描测试范围,该扫描范围内的单次曝光时间

大于10s,使用重复采集10次的方式获得最优的拉曼光谱谱图。图2给出了牛Ⅰ型胶原蛋白的特征拉

曼光谱法图谱,其中856cm-1、876cm-1、922cm-1、938cm-1、1004cm-1、1033cm-1、1246cm-1、

1271cm-1、1451cm-1、1668cm-1为胶原蛋白的特征拉曼位移。供试品谱带的拉曼位移误差应小于

上述特征值的±0.5%。

5.2.1.4 特征多肽测定法:通过胶原蛋白特征多肽进行胶原蛋白种属和/或型别鉴别时,按照YY/T1805.3

的规定,采用液相色谱-质谱联用技术进行测定,供试品应检测出特定动物种属的该型别胶原蛋白特征

多肽。

5.2.1.5 适用时,可用特异性抗体通过蛋白质免疫印迹法(Westernblot)或酶联免疫法(ELISA)进行胶

原蛋白鉴别。采用免疫印迹法应按照《中华人民共和国药典》“免疫印迹法”的要求进行,供试品应呈现

明显色带。可使用商用试剂盒进行酶联免疫法检测,供试品应有明显阳性显色反应。

注:采用非标准化方法时宜进行方法学验证。

5.2.2 胶原蛋白高级结构分析

5.2.2.1 圆二色(CD)光谱法

按照附录A 中A.1的规定进行圆二色光谱分析,胶原蛋白供试品应在221nm~222nm 出现正

峰,且在195nm~200nm 出现负峰;在221nm 处正峰和195nm 处负峰绝对值的比值处于0.09~0.15

之间。

注:胶原蛋白在CD光谱221nm 处的峰高(峰面积)与供试品中具有三螺旋结构的胶原蛋白含量在一定质量范围内

呈线性关系,能进行相对定量分析。

5.2.2.2 微量差示扫描量热法

按照A.2的规定进行,胶原蛋白供试品特征吸热峰应符合温度标示范围。

注1:牛、猪、大鼠Ⅰ型胶原蛋白特征吸热峰在(42±2)℃,罗非鱼Ⅰ型胶原特征吸热峰在(37±2)℃。

注2:生活于低温环境下的鱼类和海蜇等水生动物,胶原蛋白转换温度峰值会较低;此外,同一种鱼类在不同季节和

地域,其胶原蛋白转换温度峰值也会有所不同,需根据实际情况具体分析。

注3:胶原蛋白吸热峰面积与供试品中具有三螺旋结构的胶原蛋白含量在一定质量范围内呈线性关系,可进行相对

定量分析。

3

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图1 Ⅰ型胶原蛋白红外分光光度法谱图

图2 牛Ⅰ型胶原蛋白拉曼光谱法谱图

5.2.3 纯度

5.2.3.1 色谱法

按照《中华人民共和国药典》“色谱法”的“分子排阻色谱法”测定,按面积归一化法计算纯度,胶原

蛋白供试品纯度应符合标示范围。

注:胶原蛋白分子排阻法色谱柱可选择TSK3000SWXL凝胶色谱柱或其他适宜的凝胶色谱柱,在色谱柱中大分子

表现为保留时间较短,小分子保留时间较长。分子排阻法中二聚体或多聚体在主峰前面。二聚体或多聚体可

不作为杂质。

5.2.3.2 电泳法

按照附录B的规定,胶原蛋白供试品经特异性胶原蛋白酶作用后,通过SDS-PAGE凝胶电泳法进

行分析,供试品纯度应符合标示范围。

注:与Ⅰ型胶原蛋白伴随的Ⅲ型胶原蛋白可不作为杂蛋白。

4

YY/T1985—2025

5.2.4 含量

5.2.4.1 胶原蛋白含量可用总蛋白含量和纯度计算,胶原蛋白的含量(浓度)以“质量/质量”表示(固体)

或“质量/体积”(液体)表示。总蛋白含量的测定按照YY/T1511—2017附录A“凯氏定氮法蛋白含量

测定”进行,或按照《中华人民共和国药典》“蛋白质含量测定法 第三法 双缩脲法”进行测定。胶原蛋

白纯度按5.2.3测定。胶原蛋白含量应为标示量的90%~110%。

注:凯氏定氮法中胶原蛋白的换算系数也可按全长或去除端肽胶原蛋白理论氨基酸序列中氮元素分析确定。

5.2.4.2 去端肽胶原蛋白含量可用羟脯氨酸含量按下述方式计算,去端肽胶原蛋白含量应为标示量的

90%~110%。

———通过蛋白数据库获得去端肽胶原蛋白(不含信号肽、前肽和端肽)理论氨基酸序列中脯氨酸和

羟脯氨酸的总数。

———根据去端肽胶原蛋白供试品氨基酸组成分析获得的脯氨酸和羟脯氨酸含量,确定脯氨酸和羟

脯氨酸的实际比例。由于羟脯氨酸分子质量比脯氨酸分子质量高16Da,按照脯氨酸和羟脯

氨酸的实际测定比例,可计算去端肽胶原蛋白的分子质量。然后用羟脯氨酸分子质量总和除

以去端肽胶原蛋白分子质量,可计算出羟脯氨酸在去端肽胶原蛋白供试品的质量百分比。

———用羟脯氨酸含量除以羟脯氨酸在去端肽胶原蛋白供试品的质量百分比,即可获得供试品中去

端肽胶原蛋白含量。

注:去端肽胶原蛋白含量宜考虑端肽去除实际程度的影响。去端肽胶原蛋白分子量未考虑糖基化修饰和羟赖氨酸

修饰。

5.2.4.3 胶原蛋白羟脯氨酸含量:采用色谱法时,按照《中华人民共和国药典》“高效液相色谱法”进行测

定;采用紫外分光光度法或氨基酸分析仪法时,按照附录C的要求进行检测,胶原蛋白羟脯氨酸含量应

符合标示范围。

5.2.4.4 胶原蛋白特征多肽含量:按照YY/T1805.3的规定,采用液相色谱-质谱法进行定量检测,胶原

蛋白特征多肽含量应符合标示范围。

注:胶原蛋白特征多肽含量以单位质量总蛋白中标示型别胶原蛋白特征多肽含量表示。

5.2.5 分子质量

5.2.5.1 采用电泳法测定胶原蛋白分子质量时,按照YY/T1805.2的规定进行,供试品结果应符合标

示范围。

5.2.5.2 非变性条件下,胶原蛋白分子质量可用分子排阻色谱法检测,按照附录D的规定进行,供试品

结果应符合标示范围。

5.2.5.3 动力黏度:取供试品按照《中华人民共和国药典》“黏度测定法”的“旋转黏度计测定法”测定,需

要详细描述试验条件,胶原蛋白动力黏度值应符合所标示范围。

注:以上3种分子质量分析方法联合使用,可充分反映供试品的分子质量大小、分布及多聚体和降解信息,推荐给

出3种方法的测试结果。

5.2.6 氨基酸组成

5.2.6.1 采用色谱法进行胶原蛋白氨基酸组成分析时,按照《中华人民共和国药典》“色谱法”的“高效液

相色谱法”进行测定,供试品结果应符合标示范围。

5.2.6.2 采用氨基酸分析仪法时,制备胶原蛋白酸水解检验液来测定酸水解最终产物中的氨基酸组

成,供试品结果应符合标示范围。

5.2.6.3 色氨酸分析:胶原蛋白色氨酸含量按照附录E的规定进行,供试品结果应符合标示范围。

注:色氨酸可能存在于胶原蛋白非三螺旋端肽末端。

5

YY/T1985—2025

5.2.6.4 胶原蛋白端肽检测:对胶原蛋白端肽序列进行Blast多序列比对,选择只在某一特定来源

和/或特定类型胶原蛋白端肽序列中出现的肽段,作为其特异性的端肽特征多肽,按照YY/T1805.3的

规定进行检测,去除端肽胶原蛋白不应检出。

5.2.7 热稳定性

根据供试品的通常贮存性状(液体或固体)和预期使用性状进行相同或相似样品条件下的差示扫描

量热分析,胶原蛋白固体样品经压实剪碎再压实处理,按照《中华人民共和国药典》“热分析法”用差示扫

描量热法测定;胶原蛋白溶液样品按照附录A 的规定用微量差示扫描量热法进行测定。供试品转换温

度峰值应符合标示范围。

5.2.8 变性胶原蛋白含量

具有三螺旋结构的胶原蛋白能抵御大多数蛋白酶的消化,而变性胶原蛋白可被蛋白酶消化,通过测

定消化后分离组分的羟脯胺酸含量可反映变性胶原蛋白含量。按照附录F进行胰蛋白酶、胃蛋白酶消

化的变性胶原蛋白含量分析,变性胶原蛋白含量结果应符合标示范围。

5.2.9 胶原蛋白-细胞相互作用

5.2.9.1 细胞黏附性

按照附录G的规定进行细胞黏附性测定,阳性对照组的黏附百分比应高于阴性对照组,且具有统

计学意义(P <0.05),则试验结果成立,否则应重复该试验。胶原蛋白供试品试验组的黏附百分比较空

白对照组高且具有统计学意义(P <0.05),则判定供试品对细胞有促进黏附的作用。

5.2.9.2 细胞迁移

细胞迁移试验按照YY/T1849—2022附录C“细胞移行试验———细胞划痕法”进行检测并计算细

胞迁移率。

结果判定:阳性对照组的细胞迁移率与阴性对照组相比,其差值应>30%且具有统计学意义(P <

0.05),否则应重复该试验。胶原蛋白供试品组的细胞迁移率显著大于阴性对照组且具有统计学意义

(P <0.05),则判定供试品在该浓度下具有促进细胞迁移的能力。

注1:人表皮角质形成细胞是构成皮肤表皮的主要细胞种类,适宜用于评价终产品使用部位为皮肤的胶原原料的生

物学效应。此外,宜根据终产品使用部位,选择与其相关的细胞种类,参考本法进行试验。

注2:人角质形成细胞HaCat在培养过程中需控制传代前细胞汇合度,使其小于95%,过高汇合度会导致HaCat细

胞分化,影响测试稳定性。HaCat细胞的生长迁移能力会随培养所用胎牛血清、培养基及细胞培养过程等有

差异,具体的划痕前预处理条件需进行预实验摸索确定。

注3:供试液制备过程中避免加热(样品温度不应超过其热变性温度)或冷冻,同时避免激烈的震荡、搅拌或超声处

理,因为加热或剪切力等因素会导致样品中的胶原蛋白变性,从而影响测试结果的准确性。

注4:建议选用EGF、明胶作为阳性对照。阳性对照应按说明书保存,避免反复冻融。

注5:本法适用于检测可溶/部分可溶性的胶原蛋白样品。若采用无血清DMEM 培养基配制供试品时,胶原供试

液的体积不可超过终体积的10%。若配制好的加样样品颜色呈现黄色,可适量添加0.4mol/LNaOH 溶液进

行中和,使加样样品颜色呈桔红至红色。建议供试品胶原质量浓度大于或等于0.5mg/mL。

注6:若配制好的加样样品呈现凝胶状,无法进行转移,可在加样样品配制过程中预冷所用试剂和供试液,并在配制

完成后将加样样品保存在冰上,并尽快完成加样操作;加样样品凝胶化时间与样品的去端肽程度、样品离子强

度及加样样品温度相关,推荐冰上配置加样样品后在5min内完成加样操作。

注7:在能形成凝胶的加样样品中,气泡会影响后继的图像收集、处理和定量,加样过程中也尽量避免引入气泡;若

配制好的加样样品中有气泡,可对样品进行短暂离心(>2000g,约15s),以去除气泡。

6

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5.2.10 胶原蛋白自组装

胶原蛋白自组装性能测试按附录H 规定的方法进行,胶原蛋白供试品溶液的浊度变化曲线应呈现

典型的S形,胶原蛋白自组装过程中静滞期结束时间(tlag)、胶原蛋白自组装的生长期增长斜率(K )应

在标示范围内。

5.3 杂质、污染物和添加剂

5.3.1 概述

胶原蛋白引起关注的杂质、污染物和添加剂主要包括(但不限于):糖胺聚糖、弹性蛋白、脂类、动物

DNA、动物细胞成分、细胞培养组分、重金属、内毒素、微生物负载、酶及加工过程中使用的试剂(如酸、

表面活性剂、溶剂等)、胶原蛋白降解产物。关于胶原蛋白中存在的加工助剂和其他杂质问题,生产者或

供应商应提供工艺中可能引入的杂质信息。

5.3.2 杂蛋白

杂蛋白的检测按照附录B的规定进行,结果应符合规定限值。

去端肽胶原蛋白的杂蛋白可用蛋白总量减去5.2.4.2测定的去端肽胶原蛋白含量,结果应符合规定

限值。

注:在胶原蛋白纯化过程中残留的除目标类型胶原蛋白以外的其他蛋白质,主要包括(但不限于):弹性蛋白、蛋白

酶制剂等。与Ⅰ型胶原伴随的Ⅲ型胶原不作为杂蛋白考虑。

5.3.3 弹性蛋白

5.3.3.1 适宜时,采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定,弹性蛋白残留量应符合规定限值。

5.3.3.2 弹性蛋白残留采用测定锁链素和/或异锁链素含量时,按照附录I的规定进行,结果应符合规

定限值。

5.3.4 总糖含量(以葡萄糖计)

按照附录J的规定进行检测,胶原蛋白供试品结果应符合规定限值。

5.3.5 脂肪残留

称取干燥恒重的胶原蛋白供试品1g~2g,按照GB5009.6的规定进行测定,结果应符合规定

限值。

5.3.6 内毒素

按照《中华人民共和国药典》“细菌内毒素检查法”规定的方法测定,胶原蛋白供试品内毒素含量应

符合规定限值。

注:医疗器械产品的细菌内毒素限量要求与其与人体的接触方式等因素有关,宜考虑这些因素来规定作为原材料

的胶原蛋白的细菌内毒素限值。

5.3.7 重金属与微量元素

5.3.7.1 依据材料来源和工艺,对可能存在的重金属进行总含量检测和必要的单项重金属含量检测。

5.3.7.2 残留重金属总量按照《中华人民共和国药典》“重金属检查法”的“第二法”检测,重金属总量(以

Pb计)应≤10μg/g(质量分数)。

5.3.7.3 残留微量元素按照《中华人民共和国药典》“原子吸收分光光度法”“电感耦合等离子体原子发

7

YY/T1985—2025

射光谱法”“电感耦合等离子体质谱法”或相当的方法进行测定,其结果应符合限量要求:砷(As)≤

1μg/g,汞(Hg)≤4μg/g,铅(Pb)≤15μg/g,铬(Cr)、镉(Cd)≤50μg/g(质量分数)。预期植入用胶原

蛋白铜(Cu)、钼(Mo)、铁(Fe)、镍(Ni)均≤50μg/g(质量分数)。

5.3.8 微生物

5.3.8.1 以无菌方式提供时,应进行灭菌和无菌保证水平的工艺验证,并进行无菌检测。按照《中华人

民共和国药典》“无菌检查法”进行检测,结果应无菌。

注1:使用者宜确认灭菌方法不会对胶原蛋白造成不利影响。胶原蛋白可通过不同的方法进行灭菌,例如(但不限

于):伽马射线辐照、电子束或环氧乙烷。也可利用无菌工艺进行制备。

注2:胶原溶液多通过在胶原溶液黏度许可的情况下过滤除菌,或辐照灭菌。黏度的任何改变可能引起分子质量的

改变,宜对此种情况进行评估。

5.3.8.2 以非无菌方式提供时,每1g供试品中需氧菌总数不应超过102 CFU,霉菌和酵母菌总数不应

超过20CFU。不应检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。按照《中华人民共和国药典》

“非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法”“非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法”规定的方法

进行检测。

5.3.9 添加剂

如果使用了防腐剂、冻干保护剂等添加剂,应给出其限量要求和检测方法。

6 生物学评价

胶原蛋白在结构方面存在较少的种属间差异,其主要结构和更高级的结构在不同种属间具有高度

的相似性。然而,胶原蛋白的生物相容性还取决于其纯度、杂质成分、工艺中使用的化学试剂残留等

因素。

胶 原蛋白用于组织工程医疗产品或其他医疗器械的安全性应按照GB/T16886.1的要求,以及

GB/T44353.1、GB/T44353.2、YY/T0771.3,组织工程医疗器械产品的相关标准进行生物相容性评

价,符合《动物源医疗器械注册技术审查指导原则》(2017年版)的要求。

胶原蛋白制备工艺中使用的化学试剂也可能引起胶原蛋白免疫原性的改变。免疫原性试验宜考

虑,但不限于,按照GB/T16886.10规定进行皮肤致敏试验、按照GB/T16886.20规定进行免疫毒理学

试验。

7 原材料外源因子污染的风险控制

组织提取胶原蛋白的原材料主要为动物源组织,应建立适宜的动物供体筛查及组织采集程序,以保

证控制初始材料外源因子污染的风险。因此,宜对组织来源进行控制和相应的风险评估。参照

GB/T44353.1、GB/T44353.2进行源头控制,符合《动物源医疗器械注册技术审查指导原则》(2017年

版)的要求。

应建立病毒清除灭活工艺,以减少或消除潜在的传染性。按照YY/T0771.3进行病毒清除灭活工

艺的验证。病毒清除灭活过程应按适宜的经过验证的病毒清除灭活方案进行,符合《动物源医疗器械注

册技术审查指导原则》(2017年版)的要求。

TSE来源问题和TSE清除率:对于能耐受灭活TSE因子所要求的严苛处理方式的产品来说,宜对

原材料的来源,去除潜在TSE因子的工艺设计,以及灭活TSE因子的处理方式有细致的考量。蛋白酶

朊病毒测试的阴性结果可能不足以保证用于制备胶原蛋白的原材料是安全的,应按照YY/T0771.4进

8

YY/T1985—2025

行风险管理。

8 存储条件/货架期稳定性

理想的储存条件和货架期稳定性取决于胶原蛋白的物理形态(如溶液或固体)及其生物负载。

组织提取的冻干胶原蛋白宜储存在干燥、低温条件下。组织提取的胶原蛋白在冻干状态下的稳定

性与含水量、pH、生物负载等有关,应经过验证,确定其货架期。宜避免将组织提取的任一形式的胶原

蛋白反复冻融,因为会产生变性。

当进行胶原蛋白的储存和货架期测试时,最相关的指示稳定性的参数是那些与胶原蛋白的功能性

相关的指标,宜考虑下述参数,如:分子质量、高级结构、黏度、变性胶原蛋白、热稳定性、自组装及其他认

为相关的参数。

9 包装、运输

9.1 若生产商将胶原蛋白作为本单位研发医疗器械产品的初始材料(原材料)时,应按照医疗器械生产

中对原材料管理的质量体系进行包装、贮存、运输相关管理。

9.2 若生产商将胶原蛋白作为医疗器械研发的原材料销售时,建议参照医疗器械产品对包装、贮存、运

输的要求,提供必要的信息。品名和来源信息中应注明种属来源、组织类型、胶原型别等信息。

9

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附 录 A

(规范性)

胶原蛋白高级结构分析

A.1 圆二色光谱(CircularDichroism,CD)

A.1.1 原理

圆二色光谱(CircularDichroism,CD)是利用蛋白质分子中具有光学活性的生色基团对左、右平面

圆偏振光吸收不同,对蛋白质结构进行表征的方法,可以测定溶液状态下的蛋白质构象。

天然生物活性胶原具有三螺旋结构,胶原的CD谱图在221nm 左右的波长处有正峰,在195nm 左

右的波长处有负峰,正吸收峰是胶原三螺旋构型的圆二色谱典型特征,可以作为胶原蛋白三螺旋结构有

无的定性判定指标。加上负峰位置,说明胶原的三螺旋结构完整性,正峰与负峰的比值越大,其三螺旋

结构越完整。

通过采用有完整三螺旋结构的胶原蛋白对照品与经变性处理后失去三螺旋结构的变性胶原蛋白按

照不同比例混合,制备系列不同三螺旋结构含量的标准样品,测定其221nm 处的峰高,获得定量标准

曲线,用于供试品三螺旋结构相对含量的计算。

胶原的CD光谱性质由两个因素决定,即吸光度和CD光谱信号强度,测定时样品应具有低吸光度

和强CD光谱强度,应无吸光干扰。溶剂对检测吸收波长无干扰,样品能完全溶解在溶剂中形成均质透

明溶液。

A.1.2 试剂和对照品

A.1.2.1 冰乙酸,色谱纯。

A.1.2.2 胶原蛋白对照品:推荐使用国家医药标准物质(中国食品药品检定研究院可提供部分胶原蛋

白对照品)。

A.1.3 仪器和设备

A.1.3.1 分析天平(附有防静电装置):万分之一。

A.1.3.2 离心机。

A.1.3.3 圆二色光谱仪。

A.1.4 检测流程

A.1.4.1 待测样品制备

称取5mg胶原蛋白对照品/供试品,置于10 mL 容量瓶,加入0.5%乙酸(HAc)溶液,定容至

10mL,混合均匀,配制成质量浓度为0.5mg/mL胶原溶液,10000r/min离心5min,取上清液备用。

注:根据胶原蛋白的可溶性选择适宜的溶剂。

A.1.4.2 检测条件

取配制后的胶原蛋白对照品/供试品溶液,加入石英比色皿,置于CD 光谱仪上进行检测。具体参

数为:检测温度:20℃;样品池光径:1mm;扫描范围:180nm~260nm;扫描波长:0.1nm;扫描速度:

120nm/min。使用0.5%乙酸(HAc)溶液作为参比。对照品和供试品均平行测定三次,取平均值。

10

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注:使用其他试验条件时宜进行说明。

A.1.4.3 数据处理

用工作软件记录CD光谱数据,并做数据处理。

A.1.5 试验结果及分析

供试品不进行前处理,直接溶解、离心后通过与对照品CD 的谱图比较,根据谱峰与对照品的一致

性或差异进行有无三螺旋的定性判定。具体判定标准如下:

a) 在221nm~222nm 出现正峰,且在195nm~200nm 出现负峰;

b) 在221nm 处正峰和195nm 处负峰绝对值的比值处于0.09~0.15之间;

c) 若在221nm 处没有正峰,表明供试品没有三螺旋结构。

A.2 微量差示量热扫描法

A.2.1 原理

胶原蛋白在加热发生相变时,伴随着热量的吸收过程,具有特定的物相转换温度和相应的热焓变

化。胶原蛋白在解开三螺旋结构时,可以观察到特定的转变温度,用Tm 表示,微量差示扫描量热法可

以检测胶原结构变化的温度,在特征温度下如出现吸热峰可以佐证具有三螺旋结构。

A.2.2 试剂、仪器与设备

A.2.2.1 试剂及配置

0.5%乙酸:取冰乙酸5mL,加水稀释至1000mL。

A.2.2.2 仪器和设备

A.2.2.2.1 微量差示扫描微量热仪。

A.2.2.2.2 电子天平(精度0.0001g)。

A.2.2.2.3 真空脱气仪。

A.2.2.2.4 低温离心机。

A.2.2.2.5 涡旋仪。

A.2.2.3 耗材

0.45μm 孔径滤膜、塑料容量瓶、塑料离心管。

A.2.3 供试液制备

溶剂:0.5%乙酸。

胶原溶液或冻干样品:精密称取适量(胶原蛋白含量约5mg),置10mL塑料容量瓶中加溶剂适

量,使充分溶解后稀释至刻度,制成约0.5mg/mL的溶液,用0.45μm 滤膜过滤备用。

A.2.4 测定

升温程序:10℃平衡10min,以1℃/min速度升温至85℃,采样间隔5s。

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A.2.5 结果与判定

胶原蛋白供试品特征吸热峰应符合温度标示范围。供试品溶液Tm 出现对应的吸热峰可佐证具有

三螺旋结构;否则为无三螺旋结构。

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附 录 B

(规范性)

Ⅰ型胶原蛋白纯度测定

B.1 原理

本方法所用的胶原蛋白酶是从溶组织梭状芽孢杆菌中纯化而来,可特异性作用于Pro-X-Gly-Pro

序列的中性氨基酸(X)和甘氨酸之间的位点,这种序列在胶原蛋白中的频率很高,因此该胶原蛋白酶可

降解具有三螺旋结构的胶原蛋白,但不会降解其他蛋白质。胶原蛋白酶的特异性受制备工艺等因素的

影响,宜对其特异性进行评估。

通过对胶原蛋白酶酶解前后的样品进行电泳和考马斯亮蓝染色分析,可测定胶原蛋白纯度。

B.2 仪器与试剂

B.2.1 仪器

B.2.1.1 天平。

B.2.1.2 电泳仪。

B.2.1.3 影像分析系统。

B.2.2 试剂及溶液配制

除特别注明者外,所有试剂均不低于分析纯。

B.2.2.1 胶原蛋白酶:CAS9001-12-1。

B.2.2.2 牛血清白蛋白标准品(BSA)。

B.2.2.3 胶原蛋白对照品(应根据种属来源,选择胶原蛋白对照品)。

B.2.2.4 胶原蛋白酶消化液:按胶原蛋白酶说明书配制,配成含适当活性单位(U/mL)的消化液(建议

提前进行预试验,胶原蛋白酶消化液的活性单位以37℃下酶解4h可以完全消化对照品为宜)。

B.2.2.5 样品缓冲液(2×):分别量取0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液2.5mL、甘油2.0mL、

10%十二烷基磺酸钠4.0mL,0.1%溴酚蓝1mL,加超纯水稀释至10mL。

B.2.2.6 电泳缓冲液(5×):称取三羟甲基氨基甲烷15.1g、甘氨酸72.0g、十二烷基磺酸钠5.0g、加超

纯水稀释至1000mL,使用前稀释5倍。

B.2.2.7 考马斯亮蓝染色液:称取考马斯亮蓝R2501g,加入甲醇200 mL、冰乙酸50 mL、超纯水

250mL,混匀。

B.2.2.8 考马斯亮蓝脱色液:量取甲醇400mL、冰乙酸100mL与超纯水500mL,混匀。

B.2.2.9 分离胶浓度:12%~15%。

B.2.2.10 浓缩胶浓度:4%。

B.3 测定

B.3.1 考马斯亮蓝对BSA 的染色极限分析

B.3.1.1 BSA 溶液配制:用水将BSA 稀释成梯度浓度,质量浓度在0.001mg/mL~0.025mg/mL。

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B.3.1.2 SDS-PAGE分析:取各浓度BSA 溶液所制电泳样20μL上样进行SDS-PAGE电泳。电泳结

束后用影像分析系统对脱色后的胶片进行分析,确定考马斯亮蓝对BSA 的染色极限。

B.3.2 样品中杂蛋白分析

B.3.2.1 样品a:用0.1%~0.5%的乙酸溶解或稀释样品,使蛋白质量浓度为1mg/mL。

B.3.2.2 样品b:用胶原蛋白酶消化液配制样品,配成蛋白浓度与样品a相同,于37℃水浴作用4h。

B.3.2.3 样品c:取超纯水加胶原蛋白酶消化液,使胶原蛋白酶的浓度与样品b中的浓度相同,于37℃

水浴作用4h。

B.3.2.4 上样分析:将上述样品与2×的样品缓冲液等体积混合后,置于90 ℃~100 ℃热水中1min~

2min取出,进行SDS-PAGE电泳。样品、BSA(取染色极限量)和分子量标准品上样体积均为20μL,电泳

电压110V。电泳结束后用影像分析系统对脱色后的胶片进行分析,记录条带光密度。

B.4 结果计算

B.4.1 胶原蛋白纯度计算

B.4.1.1 当B-C≠0时,样品中胶原蛋白纯度按式(B.1)计算。

PU=A - (B -C)

A ×100% …………………………(B.1)

式中:

PU ———胶原蛋白纯度;

A ———样品a所有条带光密度之和;

B ———样品b所有条带光密度之和;

C ———样品c所有条带光密度之和。

B.4.1.2 当B-C=0时,样品中胶原蛋白纯度按式(B.2)计算。

PU=10000-M BSA

10000 ×100% …………………………(B.2)

式中:

PU ———胶原蛋白纯度;

M BSA———考马斯亮蓝确定的染色极限时加样的BSA 质量数值,单位为纳克(ng)。

B.4.2 杂蛋白含量计算

样品中杂蛋白含量按式(B.3)计算。

IP=100% -PU …………………………(B.3)

式中:

IP ———胶原蛋白杂质,%;

PU ———胶原蛋白纯度,%。

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附 录 C

(规范性)

羟脯氨酸含量测定

C.1 紫外分光光度法

C.1.1 原理

羟脯氨酸是胶原蛋白中含有的特异性氨基酸,且含量比较稳定。将试样在105 ℃和c(HCl)=

6mol/L盐酸作用下,水解成羟脯氨酸,羟脯氨酸经氯胺T 氧化后,与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色

化合物,在波长560nm 处进行比色测定。

C.1.2 仪器与试剂

C.1.2.1 仪器

C.1.2.1.1 天平。

C.1.2.1.2 紫外分光光度计。

C.1.2.1.3 恒温箱。

C.1.2.2 试剂及溶液配制

除特别注明者外,所有试剂均为分析纯。

C.1.2.2.1 L-羟脯氨酸对照品:国家对照品。

C.1.2.2.2 盐酸溶液,c(HCl)=6mol/L:将优级纯盐酸与水等体积混合。

C.1.2.2.3 pH=6.0缓冲液:称取57g三水合乙酸钠、37.5g柠檬酸三钠、5.5g一水合柠檬酸,385mL

异丙醇,加水500mL,用一水合柠檬酸调节pH 至6.0,加水稀释至1000mL。

C.1.2.2.4 氯胺T溶液:称取3.5g氯胺T,加水稀释至50mL,使用前现配。

C.1.2.2.5 氧化剂溶液:将氯胺T溶液和pH=6.0缓冲液按1∶4的比例混合。

C.1.2.2.6 60%高氯酸溶液:量取高氯酸43mL,加水稀释至50mL。

C.1.2.2.7 对二甲氨基苯甲醛溶液:称取10g对二甲氨基苯甲醛,加15mL60%高氯酸溶液溶解。

C.1.2.2.8 显色剂:量取15mL对二甲氨基苯甲醛溶液,溶于65mL异丙醇中。

C.1.2.2.9 氢氧化钠溶液,c(NaOH)=6mol/L:称取24g氢氧化钠,加水稀释至100mL。

C.1.3 L-羟脯氨酸对照品溶液制备

C.1.3.1 L-羟脯氨酸对照品储备液:取L-羟脯氨酸对照品,精密称定,加水溶解并定量稀释成每1mL

中含20μg的溶液;

C.1.3.2 L-羟脯氨酸对照品系列溶液:精密量取L-羟脯氨酸对照品储备液2.5mL、3.75mL、5.0mL、

7.5mL、10.0mL,分别置10mL容量瓶中,用水定容,配制L-羟脯氨酸对照品系列溶液。

C.1.4 供试液制备

取干燥恒重后的样品置于水解管中,精密称定,加入6mol/L HCl适量,充氮封管。105 ℃水解

22h~24h,冷却,将水解产物转移至容量瓶中,加水洗涤水解管,将洗涤液合并转移至容量瓶中,加酚

酞指示剂2滴,加6mol/LNaOH 到溶液呈粉红色为止;用水定容、摇匀,制得供试液(供试液中L-羟脯

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氨酸浓度应在对照品系列溶液浓度范围内)。

C.1.5 测定

精密量取0.5mL空白(水)、羟脯氨酸对照品系列溶液及供试液,分别加入1mL异丙醇、0.5mL

氧化剂溶液,混合后在室温下放置4min;再分别加入6.5mL显色剂,混合后,将各管放置在60℃水浴

中加热15min,冷却。用空白作对照,于560nm 测定吸光度值,以羟脯氨酸对照品溶液系列浓度对其

吸光度做直线回归,求得直线回归方程,计算出供试品溶液中羟脯氨酸含量。

C.1.6 结果与计算

样品中羟脯氨酸含量按式(C.1)计算。

Hyp=

Csa ×V

m ×104 …………………………(C.1)

式中:

Hyp———样品中L-羟脯氨酸含量(质量分数),%;

Csa ———由标准曲线得到的供试品溶液中L-羟脯氨酸的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V ———稀释体积,单位为毫升(mL);

m ———干燥恒重后样品质量,单位为克(g)。

注:本方法为仲裁方法。

C.2 氨基酸分析仪法

C.2.1 原理

羟脯氨酸、脯氨酸是胶原蛋白中含有的特异性氨基酸,且含量比较稳定。将试样在105 ℃ 和

c(HCl)=6mol/L盐酸作用下,水解成单一氨基酸,再用氨基酸分析仪测定样品中羟脯氨酸的含量。

C.2.2 仪器与试剂

C.2.2.1 仪器

C.2.2.1.1 天平。

C.2.2.1.2 氨基酸分析仪。

C.2.2.1.3 旋转蒸发仪或浓缩器。

C.2.2.1.4 恒温箱。

C.2.2.2 试剂及溶液配制

除特别注明者外,所有试剂均为分析纯。

C.2.2.2.1 L-羟脯氨酸对照品:国家对照品。

C.2.2.2.2 盐酸溶液,c(HCl)=6mol/L:将优级纯盐酸与水等体积混合。

C.2.2.2.3 洗脱用柠檬酸钠缓冲液:按仪器使用说明书配制。

C.2.2.2.4 茚三酮溶液:按仪器使用说明书配制。

C.2.3 L-羟脯氨酸对照品溶液制备

C.2.3.1 L-羟脯氨酸对照品储备液:取L-羟脯氨酸对照品适量于100mL容量瓶中,精密称定,加水溶

解并稀释至刻度。

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C.2.3.2 L-羟脯氨酸对照品溶液:精密量取L-羟脯氨酸对照品储备液,加水稀释至刻度。

C.2.4 供试液制备

取干燥恒重后的样品置于水解管中,精密称定,加入6mol/L HCl适量,充氮封管。105 ℃水解

22h~24h。冷却,置旋转蒸发仪瓶中,60 ℃减压蒸发至干。用水洗涤蒸发瓶,转移洗涤液至容量瓶

中,加水定容至刻度,制得供试液(供试液与对照品溶液中L-羟脯氨酸浓度相对偏差应在±10%内)。

C.2.5 测定

取对照品溶液、供试液用0.2μm 的膜过滤后,分别注入氨基酸分析仪进行测定。记录对照品溶液、

供试液中羟脯氨酸的峰面积。

C.2.6 结果与计算

样品中羟脯氨酸含量按式(C.2)计算。

Hyp=Cst×V ×

Asa

Ast×m ×10 …………………………(C.2)

式中:

Hyp———样品中L-羟脯氨酸含量,%;

Cst ———对照品中L-羟脯氨酸的质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

Asa ———供试液中L-羟脯氨酸的峰面积;

Ast ———对照品溶液中L-羟脯氨酸的峰面积;

V ———稀释体积,单位为毫升(mL);

m ———干燥恒重后样品质量,单位为克(g)。

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附 录 D

(规范性)

胶原蛋白分子量测定———分子排阻色谱法

D.1 原理

分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术,分离原理为凝胶色谱

柱的分子筛机制。分子排阻色谱法结合多角度激光散射检测器与示差检测器联用,测定分子质量可以

克服样品与标准品的化学组成,分子结构及大小不同带来的误差。分子质量可用重均分子质量(M w)和

数均分子质量(Mn)来表示,采用折光指数增量(dn/dc)计算,得到分子质量和分子质量分布指数。

D.2 仪器设备

分析天平、激光散射仪及示差检测器、HPLC泵、柱温箱。色谱柱用KW-803、KW-804或其他适宜

的色谱柱。

D.3 试剂

除特别注明者外,所有试剂均为分析纯。

D.3.1 冰乙酸。

D.3.2 三水合乙酸钠。

D.3.3 水为超纯水。

D.4 溶液配制

D.4.1 流动相

乙酸钠-乙酸缓冲液:称取三水合乙酸钠3.74g,加冰乙酸50mL,加水溶解并稀释至1000mL,混

匀,用0.22μm 的滤膜过滤,脱气备用。

D.4.2 样品溶液制备

准确称取样品适量,用10mL上述流动相溶解并稀释至质量浓度为0.1mg/mL~0.5mg/mL的溶

液,25℃~30℃放置使其完全溶解,用0.45μm 的滤膜过滤,滤液备用。

D.5 步骤

用流动相将基线冲至平稳后,取适量样品溶液进样,流速0.5mL/min,柱温30 ℃条件下检测样品

的分子质量及分子质量分布。

折光指数增量(dn/dc):采用流动相稀释胶原蛋白标准品或供试品(纯度大于98%)至不同浓度梯

度(0.5mg/mL~0.1mg/mL),用示差检测器测定。

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D.6 结果计算

检测完毕后,将dn/dc 值输入仪器配套的色谱分析软件,根据软件要求设置其他相关系数,计算重

均分子质量(M w)及分子质量分布指数(M w/Mn)。

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YY/T1985—2025

附 录 E

(规范性)

色氨酸含量的测定

E.1 原理

样品中的色氨酸经氢氧化锂水解,用高效液相色谱法分离,紫外检测器检测,外标法定量。

E.2 仪器与试剂

E.2.1 仪器

E.2.1.1 天平。

E.2.1.2 高效液相色谱仪,配紫外检测器。

E.2.1.3 旋转蒸发仪或浓缩器。

E.2.1.4 恒温箱。

E.2.1.5 聚四氟乙烯水解管:配衬管和密封垫。

E.2.2 试剂

除特别注明者外,所有试剂均为分析纯。

E.2.2.1 色氨酸对照品:国家对照品。

E.2.2.2 氢氧化钾溶液,c(KOH)=0.1mol/L:称取氢氧化钾0.56g,溶解于100mL水中,即得。

E.2.2.3 氢氧化锂溶液,c(LiOH)=4mol/L:称取氢氧化锂83.9g,溶解于500mL水中,即得。

E.2.2.4 乙酸钠缓冲溶液,(0.0085mol/LNa+ ,pH=4.5):称取无水乙酸钠0.70g,溶解于1000mL

水中,用冰乙酸调节pH 为4.5。

E.2.2.5 甲醇:色谱纯。

E.2.2.6 流动相:乙酸钠缓冲溶液(d)+甲醇(e)=95+5。

E.2.2.7 L-色氨酸对照品储备液:准确称取25mg(精确至0.0001g)色氨酸对照品置于25mL烧杯

中,用滴管滴加氢氧化钾溶液(b)使其溶解,将其转移至250mL 棕色容量中,用水定容,质量浓度为

100μg/mL。2℃~8℃保存,有效期为1个月。

E.2.2.8 L-色氨酸对照品系列液:准确移取L-色氨酸对照品储备液(g)0.05mL、0.125mL、0.25mL、

0.375mL、0.50mL分别置于25mL棕色容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。其溶液质量浓度分别为

0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL和2.0μg/mL。2℃~8℃保存,有效期为2周。

E.3 供试液制备

取样品50mg~100mg(精确至0.0001g)置于聚四氟乙烯水解管中,加1.5mL 氢氧化锂溶液

(c),充氮,旋紧密封后放入110℃±2℃恒温干燥箱中,水解20h。取出水解管,冷却至室温,用乙酸钠

缓冲溶液(d)将水解液定量转移25mL容量瓶中,并用上述缓冲液定容,用0.45μm 滤膜过滤后上液相

色谱仪测定。

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YY/T1985—2025

E.4 色谱条件

色谱条件如下:

a) 色谱柱:C18,250mm×4.6mm,5μm 或与之相当的柱;

b) 流动相:见E.2.2.6);

c) 流速:1.0mL/min;

d) 柱温:室温;

e) 进样体积:10μL;

f) 检测器:紫外检测器;

g) 检测波长:280nm。

E.5 测定

按上述色谱条件平衡色谱柱后,分别取色氨酸对照品系列溶液和供试液进液相色谱仪测试,记录色

谱图。

E.6 结果与计算

以色氨酸对照品系列溶液浓度-峰面积作图,得到线性方程,以外标法对供试液中色氨酸定量。

样品中色氨酸含量,按式(E.1)计算:

ω =C ×V/W …………………………(E.1)

式中:

ω ———样品中色氨酸含量,单位为微克每克(μg/g);

C ———供试液中色氨酸含量,单位为微克每毫升(μg/mL);

V ———试样稀释体积,单位为毫升(mL);

W ———试验质量,单位为克(g)。

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YY/T1985—2025

附 录 F

(规范性)

变性胶原蛋白检测———蛋白酶酶解法

F.1 原理

具有三螺旋结构的胶原蛋白可抵御大多数蛋白酶的消化,而变性的胶原蛋白容易被蛋白酶消化。

胶原蛋白供试品经过蛋白酶处理后,将消化液中的非变性胶原蛋白进行盐析回收,通过检测供试品以及

回收的非变性胶原蛋白的羟脯氨酸含量,可定量分析供试品中非变性胶原蛋白和变性胶原蛋白的含量。

本附录中包含胰蛋白酶和胃蛋白酶两种酶解处理方法。这两种酶的最适酶解条件不同,覆盖了常

见的胶原蛋白供试品的pH 和热变性温度范围。为了减少样品前处理步骤可能导致的蛋白变性,并降

低酶解过程中温度对胶原三螺旋结构的影响,应根据样品原始pH 和热变性温度选择适宜的蛋白酶进

行本试验。

胰蛋白酶在中性至弱碱性环境中活力较高,最适pH 约为8.0,在pH<3的环境中基本失去活力。

本法中胰蛋白酶酶解温度为20℃。因此,pH 为中性或弱碱性的样品,以及在溶液中热变性温度低于

或等于30℃的供试品,宜采用胰蛋白酶消化。

胃蛋白酶在酸性环境下具有较高活力,在pH>5.5的环境中基本失去活力。本法中胃蛋白酶酶解

温度为30℃。因此,pH 为酸性的样品,以及在溶液中热变性温度高于30 ℃的样品,宜采用胃蛋白酶

消化。

F.2 适用范围

本法适用于胶原蛋白溶液或可溶性的胶原蛋白固体(海绵、粉末等)中变性和非变性胶原蛋白的含

量分析,间接反映具有完整三螺旋结构的非变性胶原蛋白含量。

F.3 仪器、试剂与特殊用具耗材

F.3.1 仪器

F.3.1.1 分析天平(精度0.1mg)。

F.3.1.2 移液器。

F.3.1.3 恒温振荡培养箱。

F.3.1.4 高速离心机(最高离心力≥20000×g)。

F.3.1.5 恒温烘箱(加热温度>110℃)。

F.3.1.6 紫外可见分光光度计。

F.3.2 试剂及溶液配制

除特别注明外,所有试剂均为分析纯。

F.3.2.1 通用试剂

F.3.2.1.1 纯水。

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YY/T1985—2025

F.3.2.1.2 20μg/mLL-羟脯氨酸对照品储备液:按照C.1.3.1配制。

F.3.2.1.3 Ⅰ型胶原参比品:建议采用国家药品标准物质或者企业参比品。

F.3.2.1.4 5mol/L氯化钠溶液及2mol/L氯化钠溶液。

F.3.2.1.5 6mol/L盐酸溶液。

F.3.2.1.6 8mol/L盐酸溶液。

F.3.2.2 胰蛋白酶消化法用试剂及溶液

F.3.2.2.1 0.05mol/L乙酸溶液。

F.3.2.2.2 1mol/LNaOH 溶液。

F.3.2.2.3 1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4,含0.5mol/LNaCl)。

F.3.2.2.4 胰蛋白酶消化液:用1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4,内含0.5mol/LNaCl)溶解胰蛋白

酶,配制成含适量活力单位的胰蛋白酶消化液,建议酶活力单位不低于937U/mL。

注1:胰蛋白酶级别不低于生化级。

注2:胰蛋白酶活力以BAEE(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐)unit表示,每单位即胰蛋白酶在pH 为7.6,25℃

的条件下,以BAEE作为底物,在253nm 处每分钟产生0.001的吸光值。

注3:胰蛋白酶消化液浓度的确定宜经过试验摸索,确保其经过8×稀释后,在24h内变性胶原对照样品被完全降

解。可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,观察变性胶原对照溶液被消化后的电泳图谱是否仍存在胶原特征

条带,若无特征条带,则可判断样品已经充分消化。

F.3.2.3 胃蛋白酶消化法用试剂及溶液

F.3.2.3.1 0.1mol/L乙酸溶液。

F.3.2.3.2 胃蛋白酶消化液:用0.1mol/L乙