SN/T 1474-2025 传染性造血器官坏死病检疫技术规范

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

传染性造血器官坏死病检疫技术规范

Quarantine technical specification for infectious haematopoietic necrosis

中华人民共和国海关总署　　发　布

SN/T 1474—2025

代替SN/T 1474—2014

2025‑07‑25 发布2026‑02‑01 实施

SN/T 1474—2025

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件代替SN/T 1474—2014《传染性造血器官坏死病检疫技术规范》，与SN/T 1474—2014 相比，

除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

a) 增加了在“采样和制样”章节中样品保存及运送(见第8 章);

b) 更改了RT‑PCR 方法为套式RT‑PCR 检测(见9.2，2014 年版的9.2);

c) 增加了“实时荧光RT‑PCR”检测方法(见9.3);

d) 增加了“实时荧光RT‑RAA”检测方法(见9.4);

e) 删除了“中和试验”检测方法(见2014 年版的9.4);

f) 更改了“综合判定”(见第10 章，2014 年版的第10 章)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、广东大百汇海洋科技集团

有限公司、深圳技术大学、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国沈阳海关。

本文件主要起草人：温智清、郑晓聪、朱崧琪、刘荭、贾鹏、岳志芹、尹伟力、廖立珊、孙洁、耿庆华、吴江、

王津津、朱裕敏。

本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为：

——2004 年首次发布为SN/T 1474—2004;

——2014 年第一次修订为SN/T 1474—2014;

——本次为第二次修订。

Ⅰ

SN/T 1474—2025

传染性造血器官坏死病检疫技术规范

1 范围

本文件描述了传染性造血器官坏死病的病毒分离、套式RT‑PCR、实时荧光RT‑PCR、实时荧光

RT‑RAA、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验检测方法和综合判定方法。

本文件适用于传染性造血器官坏死病的诊断、检疫和监测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

文件。

GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 18088　出入境动物检疫采样

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CPE：细胞病变效应(Cytopathic effect)

Ct：循环阈值(Cycle threshold)

dNTPs：三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleotide triphosphates)

DEPC：焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate)

EPC：鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma Papulosum cyprini)

EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)

ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme‑linked immunosorbent assay)

FBS：胎牛血清(Fetal bovine serum)

FHM：肥头鲤细胞系(Fathead minnow)

FITC：异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate)

HEPES：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸[4‑(2‑hydroxyethyl)‑1‑piperazineethanesulfonic acid]

HRP：辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)

IHN：传染性造血器官坏死病(见附录A)(Infectious haematopoietic necrosis)

IHNV：传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus)

IPNV：传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreas necrosis virus)

RNA：核糖核酸(Ribonucleic acid)

RT‑PCR：逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction)

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RT‑RAA：逆转录重组酶介导链替换核酸扩增(Reverse transcription‑recombinase‑aid amplification)

T 值：阈值时间(Time threshold)

5 仪器和设备

5.1 24 孔、96 孔细胞培养板、细胞培养瓶。

5.2 组织研磨器或无菌研钵。

5.3 恒温培养箱(15 ℃、25 ℃)。

5.4 倒置荧光显微镜。

5.5 PCR 扩增仪。

5.6 实时荧光PCR 仪。

5.7 恒温荧光检测仪。

5.8 水平电泳仪。

5.9 凝胶成像仪。

5.10 酶标仪(450 nm)。

5.11 普通冰箱和-80 ℃冰箱。

5.12 低温冷冻离心机(12 000 r/min)。

5.13 微量移液器(0.5 μL、2 μL、100 μL、1 000 μL)。

6 试剂和材料

6.1 水：符合GB/T 6682 中一级水的规格。

6.2 DEPC 水：配制方法按附录B 中B.1 或购买商品化试剂。

6.3 IHNV 参考株：保藏号ch20101008。

6.4 鱼类细胞系：EPC、FHM。

6.5 细胞培养液1：按B.2。

6.6 细胞培养液2：按B.3。

6.7 胰蛋白酶‑EDTA 消化液：按B.4。

6.8 Taq DNA 聚合酶：-20 ℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

6.9 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmol/L。

6.10 RNA 酶抑制剂：-20 ℃保存，避免温度剧烈变化。

6.11 AMV 逆转录酶：-20 ℃保存，避免温度剧烈变化。

6.12 套式RT‑PCR 用引物，浓度为20 μmol/L，序列如下。

第一轮PCR 引物序列：

IHNV F1：5 ′‑AGAGATCCCTACACCAGAGAC‑3 ′

IHNV R1：5 ′‑GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAA‑3 ′

扩增IHNV 糖蛋白基因中大小为693 bp 的片段。

第二轮PCR 引物序列：

IHNV F2：5 ′‑TCACCCTGCCAGACTCATTGG‑3 ′

IHNV R2：5 ′‑ATAGATGGAGCCTTTGTGCAT‑3 ′

扩增IHNV 糖蛋白基因中大小为483 bp 的片段。

6.13 实时荧光RT‑PCR 用引物和探针，浓度为20 μmol/L，检测IHNV 核蛋白基因片段，序列如下。

IHNV N 796F：5 ′‑AGAGCCAAGGCACTGTGCG‑3 ′

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IHNV N 875R：5 ′‑TTCTTTGCGGCTTGGTTGA‑3 ′

IHNV N 818T：5 ′‑FAM‑TGAGACTGAGCGGGACA‑NFQ/MGB‑3 ′

6.14 实时荧光RT‑RAA 用引物和探针，浓度为10 μmol/L，检测IHNV 糖蛋白基因片段，序列如下。

IHNV‑RAA F：5 ′‑TATCTRGACGATCTKGTGAAGGCCTC‑3 ′

IHNV‑RAA R：5 ′‑CACAGCGACCGTCATGCACATCCCGT‑3 ′

探针：5 ′‑TATCAACAAACAGTGTGACTCCATACC[FAM‑dT]C[THF]C[BHQ‑dT]ATCYAARTTCCG(

C3 spacer)‑3 ′

6.15 无水乙醇：分析纯，使用前预冷至-20 ℃。

6.16 TAE 缓冲液：按B.5。

6.17 PBS：按B.6。

6.18 PBST：按B.7。

6.19 封闭液：按B.8。

6.20 固定液：按B.9。

6.21 抗体：抗IPNV 血清、抗IHNV 血清和单克隆抗体。

6.22 HRP 标记的抗鼠或抗兔抗体。

7 临床诊断

病鱼通常表现为游动迟缓，呆滞不动和避开水流;也有的鱼表现为螺旋游泳、狂暴乱窜、打转等活动

异常现象。皮肤发暗，眼球突出，鳃丝苍白，腹部膨胀，鳍基充血，不透明的黏液状管状粪便悬挂于肛门。

传染性造血器官坏死病的流行病学特征见附录A。

8 样品采集及处理

8.1 采样

样品需采集活的、发病的、濒死的鱼和鱼卵，采样数量按照GB/T 18088 的规定执行。采样时应避免

采集肝脏和胃肠。体长小于4 cm 的鱼苗取整条;体长4 cm~6 cm 的鱼苗取肾脏在内的所有内脏;体长

大于6 cm 的鱼取脑、脾和肾，成熟雌鱼还需取其卵巢液;鱼卵仅取卵膜。

8.2 样品运送及保存

样品运送过程需充氧以保持鱼类的存活，尽快送到实验室;取鱼的组织需加入含有10% 胎牛血清

(FBS)和抗生素的细胞培养基样品运送液后，在冷藏条件下，24 h 内送达实验室。

8.3 制样

称取0.5 g 以上组织，用无菌手术剪刀将其剪碎并研磨成糊状，用细胞培养液1 按照10 mL/g 比例

将研磨后的组织重悬(将此组织液称为1∶10 稀释度)。卵巢液不必匀浆，用细胞培养液1 将其稀释2 倍。

15 ℃孵育4 h 或4 ℃孵育过夜。4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清用于后续试验。

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9 实验室诊断

9.1 病毒分离

9.1.1 单层细胞的制备

用胰蛋白酶‑EDTA 消化液消化EPC 或FHM 细胞后，用细胞培养液2 重悬细胞，加入细胞培养板，

25 ℃培养，使细胞生长至单层。

9.1.2 中和IPNV

用细胞培养液2 将1∶10 稀释度组织上清液连续稀释至1∶100 和1∶1 000。将1∶10、1∶100 和

1∶1 000 组织稀释液分别与适当浓度的抗IPNV 血清等量混合，15 ℃孵育1 h。抗IPNV 血清中和效价

不低于2 000。若样品来自于IPNV 无疫区或确定未感染IPNV，此步骤可以省略。

9.1.3 接种细胞

将以上3 个不同稀释度的组织上清液分别接种至新鲜的EPC 或FHM 单层细胞，每个稀释度至少

3 孔，每孔的细胞单层最多接种100 μL，组织上清液与细胞维持液的比例为1∶10。同时，设立阳性对照

和空白对照，阳性对照孔中接种IHNV 参考株，空白对照孔中接种相同体积细胞培养液2。15 ℃培养，倒

置显微镜下连续观察7 d~10 d。

9.1.4 盲传

首次接种细胞7 d~10 d 后未出现CPE，需进一步盲传。将细胞培养物反复冻融3 次，收集至无菌

离心管。4 ℃、7 000 r/min 离心15 min 或用直径0.45 μm 滤器滤除细胞碎片，取上清。用细胞培养液2

将上清液稀释至1∶10 和1∶100，将上清液、1∶10 和1∶100 稀释液接种于新鲜的EPC 或FHM 单层细胞，

至少3 孔，组织上清液接种量与孔内细胞培养液比例为1∶10。同时，设立阳性对照和空白对照。15 ℃培

养，倒置显微镜下连续观察7 d~10 d。

9.1.5 结果判定

IHNV 感染EPC 或FHM 细胞后，可出现典型CPE，表现为局部细胞变圆、皱缩和裂解，以此为中心

周围细胞的病变范围扩大，形成明显空斑，最终细胞呈拉网状直至全部悬浮脱落。

在空白对照细胞正常，阳性对照细胞出现CPE 的情况下，样品接种细胞并盲传后均无CPE 出现，判

定病毒分离结果为阴性;若样品接种细胞或盲传后有CPE 出现，确定为疑似感染，应立即应用套式

RT‑PCR、实时荧光RT‑PCR、实时荧光RT‑RAA、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验中方法进行

IHNV 鉴定。若阳性对照未出现CPE，则应换用一批细胞(EPC 或FHM)和新的组织样品重新进行

试验。

9.2 套式RT‑PCR

9.2.1 对照设立

从核酸抽提起，每步试验均需要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用含IHNV 的病毒悬液或核

酸作为阳性对照，用正常细胞悬液作为阴性对照，以DEPC 水代替样品作为空白对照。

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9.2.2 RNA 提取

取250 μL 待检样品组织上清液或细胞培养物至无RNA 酶的1.5 mL 离心管，加入600 μL Trizol 溶

液，剧烈震荡混匀后，室温放置5 min。加200 μL 氯仿，盖紧盖子，剧烈摇动15 s，室温放置3 min。4 ℃、

12 000 r/min 离心15 min。吸取上清至新的无RNA 酶离心管，加入500 μL 预冷的异丙醇，上下翻转混

匀，室温放置10 min。4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。缓慢弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去

除。加入1 000 μL 预冷的75% 乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，弃上清，将离心

管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5 min~10 min。加入20 μL DEPC 水，4 000 r/min 离心5 s，室温溶解

10 min。-80 ℃保存备用。

在试验过程中，可采用经验证合格的商品化RNA 抽提试剂盒，按照试剂盒使用说明书操作代替以

上方法。

9.2.3 第一轮PCR 扩增

9.2.3.1 反应体系

在冰盒上配制25 μL RT‑PCR 反应体系。在PCR 反应管中加入：10×一步法RT‑PCR 缓冲液(不

含Mg2+)2.5 μL，dNTPs(各10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，引物F1 和R1 各0.5 μL，RNA

酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL，AMV 逆转录酶(5 U/μL)0.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，样品

RNA 或对照2.5 μL，加DEPC 水至总体系25 μL，混匀离心后置于PCR 仪中。

9.2.3.2 反应程序

50 ℃逆转录30 min;95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 个循环;

72 ℃再延伸7 min;4 ℃保存。

第一轮PCR 扩增反应结束后，可将PCR 产物进行电泳分析，若出现693 bp 大小目的条带，可直接

进行测序分析，否则需进行第二轮PCR 扩增。

可采用经验证合格的商品化RT‑PCR 试剂盒，按照试剂盒使用说明书操作代替以上方法。

9.2.4 第二轮PCR 扩增

9.2.4.1 反应体系

在冰盒上配制25 μL PCR 反应体系。在PCR 反应管中加入：10×Taq DNA 聚合酶缓冲液(不含

Mg2+)2.5 μL，dNTPs(各10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，引物F2 和R2 各0.5 μL，Taq DNA

聚合酶(5 U/μL)1 μL，第一轮RT‑PCR 产物2.5 μL，加DEPC 水至总体系25 μL，混匀混匀离心后置于

PCR 仪中。

9.2.4.2 反应程序

95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 个循环;72 ℃再延伸7 min;

4 ℃保存。

可采用经验证合格的商品化PCR 试剂盒，按照试剂盒使用说明书操作代替以上方法。

9.2.5 琼脂糖电泳

用新鲜配制的1×TAE 电泳缓冲液配制1.5% 琼脂糖凝胶，加入适量的电泳核酸染料。将5 μL

PCR 产物与1 μL 6×上样缓冲液混匀后加入样品孔，设DNA Marker 同步电泳;采用5 V/cm~8 V/cm，

电泳0.5 h~1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。

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可使用同等效果的其他方法，例如毛细管电泳分析仪。

9.2.6 测序

对693 bp 或483 bp 特异性PCR 扩增产物进行基因测序，并将测序结果与参考序列(见附录C)或

GenBank 数据库IHNV 基因序列进行同源性比较分析。

9.2.7 结果判定

9.2.7.1 阳性对照经第一轮PCR 扩增出现大小为693 bp 的特异性目的条带，或经第二轮PCR 扩增出现

大小为483 bp 的特异性目的条带，同时阴性对照和空白对照均无上述特异性目的条带，试验有效。否则

试验无效，应重新进行试验。

9.2.7.2 被检样品经第一轮PCR 扩增出现大小为693 bp 的特异性目的条带，或经第二轮PCR 扩增出现

大小为483 bp 的特异性目的条带，且测序结果与参考序列或GenBank 中IHNV 基因序列同源性≥

95%，判定套式RT‑PCR 检测结果为阳性。

9.2.7.3 被检样品无扩增或扩增出条带不是目的大小条带，或虽出现与目的条带大小相近的条带但测序

结果与参考序列或GenBank 中IHNV 基因序列同源性<95%，判定套式RT‑PCR 检测结果为阴性。

9.3 实时荧光RT‑PCR

9.3.1 对照设立

按9.2.1 操作。

9.3.2 RNA 提取

按9.2.2 操作。

9.3.3 反应体系

在冰盒上配制25 μL 反应体系。在PCR 反应管中加入：10×一步法RT‑PCR 缓冲液(不含Mg2+)

2.5 μL，dNTPs(各10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，引物IHNV N 796F(20 μmol/L)0.5 μL，

引物IHNV N 875R(20 μmol/L)0.5 μL，探针IHNV N818T(20 μmol/L)0.5 μL，RNA 酶抑制剂(40 U/μL)

0.5 μL，AMV 逆转录酶(5 U/μL)0.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，样品RNA 或对照 2.5 μL，加

DEPC 水至总体系25 μL，混匀离心后置于置于荧光PCR 仪中。

9.3.4 反应程序

50 ℃反转录15 min;95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s、60 ℃ 退火60 s，40 个循环。每次循环收集

一次荧光信号，循环结束后，确定Ct 值。

可采用经验证合格的商品化荧光RT‑PCR 试剂盒。反应参数可根据反应体系和不同品牌PCR 仪

做适当调整。

9.3.5 结果判定

9.3.5.1 当阳性对照出现典型扩增曲线且Ct 值≤36，阴性对照和空白对照无Ct 值无扩增曲线，试验有

效。否则试验无效，应重新进行试验。

9.3.5.2 被检样品出现典型扩增曲线且Ct 值≤36，可判定实时荧光RT‑PCR 方法检测结果阳性;被检样

品无Ct 值无扩增曲线，可判定实时荧光RT‑PCR 方法检测结果阴性。

9.3.5.3 被检样品36

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的对数增长期，判定实时荧光RT‑PCR 检测结果阳性;否则为阴性。

9.4 实时荧光RT‑RAA 方法

9.4.1 对照设立

按9.2.1 操作。

9.4.2 RNA 提取

按9.2.2 操作。

9.4.3 反应体系

在冰盒上配制50 μL 反应体系。在PCR 反应管中加入RT‑RAA 预混液25 μL，上游引物2 μL，下

游引物2 μL ，探针0.6 μL，去离子水12.9 μL，RNA 模板5 μL 混合均匀后加入到RAA 冻干酶粉的反应

管中，再加入280 mmol/L 醋酸镁2.5 μL，充分混匀离心后，将配制好的反应体系在恒温荧光检测仪上进

行检测。

9.4.4 反应程序

39 ℃，20 min，在反应过程中实时监测荧光信号。

9.4.5 结果判定

9.4.5.1 阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的T 值≤15 min;阴性对照和

空白对照无荧光对数增长，相应的无报告T 值，试验有效。否则试验无效，应重新进行试验。

9.4.5.2 被检查样品T 值≤18 min，且出现典型的扩增曲线，则判定被检样品实时荧光RT‑RAA 方法检

测阳性;如被检样品无T 值或无荧光对数增长，则判定被检样品实时荧光RT‑RAA 方法检测阴性。

9.4.5.3 如被检样品18 min

 

9.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

9.5.1 对照设立

取已知含有IHNV 参考株的病毒悬液作为阳性对照，未感染病毒的细胞悬液作为阴性对照。

9.5.2 试验步骤

9.5.2.1 用PBS 将抗IHNV 血清或单克隆抗体稀释至适当工作浓度，加至酶标板，每孔200 μL，4 ℃孵

育过夜。

9.5.2.2 弃包被液，用PBST 漂洗4 次。

9.5.2.3 每孔加200 μL 5% 脱脂乳封闭液，37 ℃孵育1 h。

9.5.2.4 弃封闭液，PBST 漂洗4 次。

9.5.2.5 向被检病毒悬液中加入Triton X‑100，加入量为总体的2%，充分混匀。

9.5.2.6 用PBST 分别将被检病毒悬液、阳性对照、阴性对照做2 倍系列稀释，并加入酶标板，每孔100 μL，

20 ℃孵育1 h。

9.5.2.7 弃病毒悬液，PBST 漂洗4 次。

9.5.2.8 加100 μL 抗IHNV 血清或抗IHNV 单克隆抗体，37 ℃孵育1 h。该步骤使用的抗体所针对的

IHNV 抗原表位应不同于包被用抗体。

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9.5.2.9 从PBST 漂洗4 次。将HRP 标记的抗体稀释至工作浓度并加入酶标板，每孔100 μL，20 ℃孵

育1 h。

9.5.2.10 用PBST 漂洗4 次。每孔加100 μL 显色液，避光显色。

9.5.2.11 当阳性对照开始显色，而阴性对照未显色时，加2 mol/L 硫酸溶液终止反应，每孔200 μL。

9.5.2.12 酶标板置于酶标仪，450 nm 波长测定OD 值(A450 值)。

9.5.3 结果判定

阳性对照孔A450 值(P)与阴性对照孔的A450 值(N)之比不小于5.0(即P/N≥5.0)，表明对照成立。

当被检样品孔A450 值(T)与阴性对照孔的A450 值(N)之比大于或等于5.0(即T/N≥5.0)判定为阳性，否

则判定为阴性。

采用经验证合格的其他商品化试剂盒，结果判定参考该试剂盒说明。

9.6 间接免疫荧光试验

9.6.1 制备细胞培养的样品

9.6.1.1 用细胞培养液2 在细胞培养板或飞片上制备单层EPC 或FHM 细胞，25 ℃培养至长满80% 单

层细胞(生长时间不超过24 h)。

9.6.1.2 当准备好用作感染的单层细胞后，在传入细胞的当天或第二天，将10 倍稀释的待鉴定的病毒悬

液(由9.1 出现CPE 的细胞培养物制备)接种到细胞培养孔。每个待鉴定的病毒培养物接种6 孔，阳性

对照2 个、阴性对照2 个。每孔病毒悬液接种量与细胞培养液2 的比例为1∶10。

9.6.2 对照设立

9.6.2.1 阳性对照：将含有IHNV 参考株的病毒悬液稀释至5 000 PFU/mL~10 000 PFU/mL，接种单层

细胞，病毒悬液接种量与细胞培养液2 的比例为1∶10。

9.6.2.2 阴性对照：加入等体积细胞培养液2。

9.6.3 操作方法

9.6.3.1 将加样后的细胞培养板或飞片15 ℃ 培养24 h，弃细胞培养液2，立即用PBS 轻轻漂洗细

胞1 次。

9.6.3.2 用-20 ℃预冷的固定液轻轻漂洗细胞3 次。加500 μL 固定液，室温固定15 min。

9.6.3.3 缓慢弃固定液，使单层细胞室温风干30 min。如不立即使用可置于-20 ℃存放待用。

9.6.3.4 用PBST 将IHNV 单克隆抗体稀释至适当工作浓度。

9.6.3.5 用PBST 将单层细胞缓慢漂洗4 次，每孔300 μL。

9.6.3.6 彻底弃除PBST，加稀释好的IHNV 单克隆抗体，每2 cm2 细胞加250 μL。将加入单抗后的单

层细胞置于湿盒内，37 ℃孵育1 h。

9.6.3.7 用PBST 缓慢漂洗4 次，每孔300 μL。

9.6.3.8 彻底弃除PBST，加入按照供应商的操作说明稀释到工作浓度FITC 标记的荧光抗体，每2 cm2

细胞加250 μL，在37 ℃下反应1 h。

9.6.3.9 用PBST 缓慢漂洗4 次，每孔300 μL。

9.6.3.10 直接将细胞培养板置于荧光显微镜下，或用pH8.5 甘油封片后置于在荧光显微镜下观察结果。

9.6.4 结果判定

阳性对照可见清晰的绿色荧光，阴性对照没有任何荧光或仅有微弱绿色背景荧光，表明对照成立。

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被检样品可见清晰的绿色荧光，则判定为阳性;若被检样品没有任何荧光或与细胞对照孔一样，均出现微

弱绿色背景荧光，则判定为阴性。

采用经验证合格的其他商品化试剂盒，结果判定参考该试剂盒说明。

10 综合判定

10.1 可疑病例

满足以下任一条件可判定为可疑病例：

——样品为IHNV 易感鱼类且具有典型临床症状;

——病毒分离培养后出现典型CPE;

——套式RT‑PCR、实时荧光RT‑PCR 和实时荧光RT‑RAA 方法中，任一种方法检测结果为阳性。

10.2 IHNV 感染

满足以下任一条件可判定为IHNV 感染：

——套式RT‑PCR 和实时荧光RT‑PCR 结果均为阳性;

——套式RT‑PCR 和实时荧光RT‑RAA 结果均为阳性;

——实时荧光RT‑PCR 和实时荧光RT‑RAA 结果均为阳性;

——病毒分离出现典型CPE，且病毒分离物经套式RT‑PCR、实时荧光RT‑PCR、实时荧光RT‑RAA、

酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验中任一方法检测结果阳性。

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附录A

(资料性)

传染性造血器官坏死病

A.1 病原学

IHNV 病毒颗粒呈子弹状，长约150 nm~190 nm ，直径约65 nm~75 nm ，是一种基因组大小为

11 000 bp、不分截段、单股负义RNA 病毒，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)

。基因组主要编码六个结构蛋白，核蛋白(Nucleocapsid protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基

质蛋白(Matrix protein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)、非结构蛋白(Non‑virion protein，NV)和RNA 依赖

的RNA 聚合酶(Polymerase protein，L)。其中，编码糖蛋白的基因与病毒抗原表位、病毒受体等有关，也

是IHNV 遗传进化分析常用的目标基因序列。目前，IHNV 包括5 个基因型，即U、M、L、E 和J 基因型。

基因型和地域分布有密切关系，U 和L 基因型主要分布于北美洲和日本地区;M 基因型主要分布于北美

洲地区;E 基因型主要分布于欧洲国家;J 基因型主要分布于日本、韩国和中国等亚洲地区。

A.2 易感宿主

多为冷水性鱼类，包括虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、大鳞大马哈鱼(O. tshawytscha)、红大马哈鱼(O.

nerka)、狗鱼(O. gorbuscha)、银大马哈鱼(O. kisutch)、大西洋鲑鱼(Salmo salar)、七彩鲑(S. trutta)、湖红

点鲑(Salvelinus namaycush)、日本淡水鲑(Plecoglossus altivelis)。一些非鲑科鱼类对IHNV 也易感，包括

鲱鱼(Clupea pallasi)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)、美洲白鳟(Acipenser transmontanus)、白斑狗鱼(Esox

lucius)、海鲈鱼(Cymatogaster aggregata)，幼鱼对IHNV 的敏感性高于成鱼。

A.3 易感阶段和水温

鱼苗是最易受感染的阶段，对感染的抵抗力通常随着鱼龄的增长而增加。该病主要在水温8 ℃~

15 ℃时流行。在自然条件下，临床症状通常发生在15 ℃以下，但在3 ℃~18 ℃水温下均会造成死亡。当

水温上升到18 ℃以上该病很快停止(形成干扰素、抗体)，但此时病毒还能在体内存活数月。

A.4 传染源和传播途径

主要通过受污染的水或与受IHNV 感染的鱼共生而造成水平传播。

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附录B

(规范性)

试剂及其配制

B.1 DEPC 水

每升去离子水中加入1 mL DEPC，用力摇匀，使DEPC 充分混匀在水中，于37 ℃ 下放置12 h，然后

121 ℃ 15 min 高压灭菌后备用。

B.2 细胞培养液1

含有1 000 IU/mL 青霉素、800 μg/mL 链霉素和10% FBS 的M199 细胞培养液。按说明书配制

M199 细胞培养液，加入10% FBS 以及相应浓度的抗生素，抽滤除菌，4 ℃保存。

B.3 细胞培养液2

含有100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和10% FBS 的Eagle′s MEM 或M199 细胞培养液。按

说明书配制MEM 或M199 细胞培养液，加10% FBS 以及相应浓度的抗生素，抽滤除菌，开放系统使用

时，加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02 mol/L，4 ℃保存。

B.4 胰蛋白酶‑EDTA 消化液

NaCl 0.8 g

KCl 0.02 g

KH2PO4 0.02 g

K2HPO4 0.115 g

EDTA 0.02 g

胰酶0.1 g

双蒸水100 mL

1 moL/L 盐酸调pH 至7.7，过滤除菌后分装备用。

B.5 TAE 缓冲液(50×TAE 贮存液)

三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242.0 g

冰乙酸57.1 mL

05 mol/L EDTA(pH 8.0) 100.0 mL

加双蒸水至1 000 mL。

将50×TAE 贮存液作50 倍稀释可得1×TAE 缓冲液。

B.6　0.01 mol/L PBS

NaCl 8.5 g

KCl 0.2 g

Na2HPO4·12H2O 2.83 g

KH2PO4 0.2 g

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将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为1 000 mL，调pH 至7.2，121 ℃高压灭菌20 min，室

温保存。

B.7 PBST

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH2PO4 0.2 g

Na2HPO4·12H2O 2.9 g

双蒸水1 000 mL

Tween‑20 0.5 mL

摇匀后，4 ℃保存。

B.8 封闭液

脱脂乳5 g

PBST 100 mL

摇匀后，4 ℃保存。

B.9 固定液

丙酮3 mL

乙醇7 mL

充分混匀后，室温放置，备用。

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附录C

(资料性)

IHNV 参考序列

C.1 套式RT‑PCR 方法参考序列(IHNV G 基因片段)，参考基因序列以IHNV 220‑90 分离株(Gene‑

Bank accession No. GQ413939)全基因组为模板。

AGAGATCCCTACACCAGAGACTTTCTGGACTCAGATTTTGTTGGAGGAAAATGCACTAAA

IHNV F1

TCACCCTGCCAGACTCATTGGTCCAACGTAGTTTGGATTGGTGATGCAGGGATACCAGCCTGTGACG

IHNV F2

CCAGCCCAGAAATAAACGGTCACCTCTTTGTTGATAAAATCTCCGGTCGAGCCGTGAAGG

CAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCGGGCCTGTATGATTGCATTCTGTG

GGGGGCAGTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTGATATCTGTAGCATACAATTCTGGA

TCAAAAACCCTCTCTTTCCCGAAGTGTGAGGACAAGACGGTGGGGATGAGGGGAAACCT

GGATGACTTTGCCTATCTAGACGACCTGGTGAAGGCCTCAGAGAGCAGAGAGGAATGTC

TTGAGGCGCATGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCCAAG

TTCCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCCATCTAT

CATGGGATGTGCATGACGGTCGCTGTGGACGAGGTAT IHNV R2

CCAAGGACAGGACGACGTACAGGGCCCATCACGCCACCAACTTCACTAAATGGGAACGAC

CCTTTGGGGATGAGTGGGAAGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACATCACC

IHNV R1

C.2 实时荧光RT‑PCR 方法参考基因序列(IHNV N 基因片段)。

AGAGCCAAGGCACTGTGCGCCATGAGACTGAGCGGGACAGGGATGACAATGGTGGGACTGT

IHNV N796F IHNV N818T

TCAACCAAGCCGCAAAGAA

IHNV N875R

C.3 实时荧光RT‑RAA 方法参考基因序列(IHNV G 基因片段)。

TATCTAGACGACCTGGTGAAGGCCTCAGAGAGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCATGCCG

IHNV‑RAA F

AGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCTAAGTTCCGATCTCCACATCCCGGA

探针

ATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCCATCTATCATGGGATGTGCATGACGGTCGCTGTG

IHNV‑RAA R