T/CVMA 232-2025 猪星状病毒五型荧光PCR检测方法

　　ICS 11.220

CCS B 41

团体标准

T/CVMA 232—2025

猪星状病毒五型荧光PCR 检测方法

Detection of porcine astrovirus type 5 fluorescent PCR

2025 - 4 - 27 发布2025 - 4 - 27 实施

中国兽医协会发 布

T/CVMA 232—2025

I

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由河南农业大学提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：河南农业大学、河南省科学院、河南省农畜水产品检验技术研究院、牧原食品股

份有限公司。

本文件主要起草人：胡慧、魏战勇、李明凤、张越、靳晓慧、史晨曦、夏璐、郑兰兰、刘占通、牛

旻、李彦朋、项玉强、孙娟、马世杰、李泽辉、郭东辉、王菲菲。

T/CVMA 232—2025

1

猪星状病毒五型荧光PCR 检测方法

1 范围

本文件规定了猪星状病毒五型感染的荧光PCR检测方法。

本文件适用于对猪星状病毒五型感染的病原学检测及临床病例诊断等，可用于不同样品中猪星状病

毒五型的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

文件。

NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对(base pair)

cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid)

Ct 值：循环阈值(cycle threshold)

DEPC：焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)

DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

PAstV 5：猪星状病毒五型(porcine astrovirus 5)

PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)

PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)

5 临床诊断

5.1 流行病学

PAstV 5广泛流行于我国猪群中，各日龄均能感染，其中哺乳仔猪和断奶仔猪阳性率最高。PAstV 5

自发现以来一直是我国PAstV流行的主要基因型。

5.2 临床症状

T/CVMA 232—2025

2

PAstV 5是一种可引起仔猪腹泻的肠道传染病病毒，主要导致仔猪出现呕吐、腹泻，仔猪生长迟缓

等症状。患病猪出现上述临床症状时，可作为判断标准之一。

5.3 病理变化

小肠上皮细胞局部坏死，绒毛轻微萎缩或脱落。

5.4 结果判定

易感动物出现5.2临床症状或5.3病理变化时，可以初步判定为PAstV 5疑似病例。确诊应按照NY/T

541规定的要求采集样品，并进行实验室检测。

6 样品的采集与处理

6.1 采样工具

6.1.1 器械：解剖刀、剪刀、镊子、药匙、注射器及针头、组织匀浆器等。

6.1.2 容器：离心管、样品保存管等。

6.1.3 个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。

6.1.4 其他：微孔滤器、采样单、记号笔、防水标签、封口膜、冰袋等。

6.2 试剂材料

6.2.1 0.01 mol/L PBS，按照附录A 中的A.1 配制。

6.2.2 青霉素，浓度为10 000 IU/mL。

6.2.3 链霉素，浓度为10 000 μg/mL。

6.3 样品采集

6.3.1 组织样品：用无菌剪刀剪取发病仔猪的小肠组织0.5 g ~ 1.0 g 作为待检样品，置于离心管。

6.3.2 粪便及肠内容物样品：用无菌的药匙，刮取新鲜粪便及肠内容物，放置于离心管。

6.4 样品处理

6.4.1 组织样品：采集的肠组织(经剪碎处理)，按1:5 的比例加入终浓度为100 IU/mL 青霉素、100

μg/mL 链霉素的0.01 mol/L PBS，反复研磨至糊状，将研磨好的病料反复冻融3 次，4 ℃ 3 000 rpm 离

心20 min，上清液用0.22 μm 微孔滤器过滤，收集样品滤液。

6.4.2 粪便及肠内容物样品：采集的粪便或肠内容物，按1:5 的比例加入终浓度为100 IU/mL 青霉素、

100 μg/mL 链霉素的0.01 mol/L PBS，震荡混匀，4 ℃ 3 000 rpm 离心20 min，上清液用0.22 μm 微孔滤

器过滤，收集样品滤液。

6.5 存放与运输

T/CVMA 232—2025

3

采集的样品与冰块或干冰一起放入保温箱，密封，在保温箱外喷洒消毒液，立即送到实验室检测。

处理后样品在4 ℃ ~ 8 ℃条件下保存应不超过24 h;若需长期保存，应放置于-80 ℃冰箱，避免反复冻

融。

7 荧光PCR 检测方法

7.1 主要仪器和设备

7.1.1 荧光定量PCR 仪。

7.1.2 台式高速冷冻离心机。

7.1.3 可调微量移液器(10 μL、200 μL、1 000 μL 等不同规格)。

7.2 主要试剂和材料

7.2.1 TRIZOL。

7.2.2 氯仿。

7.2.3 异丙醇。

7.2.4 DEPC 处理水，按照附录A 中的A.2 配制。

7.2.5 商品化反转录试剂盒。

7.2.6 商品化探针法荧光定量PCR 酶混合物。

7.3 阳性对照

含有猪星状病毒五型ORF1a基因片段的重组质粒按照附录B制备。

7.4 阴性对照

pMD18-T空载体质粒。

7.5 样品制备

按照6.4 处理临床样品。

7.6 RNA 提取

TRIZOL法：取被检样品200 μL，加入700 μL TRIZOL，混匀后，室温放置10 min;加入氯仿140 μL，

振荡混匀后，4℃ 10 000 rpm离心15 min;取上层水相约600 μL，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放

置2 h，4℃ 10 000 rpm离心15 min;弃上清，加入1 mL 75 %乙醇(用DEPC处理水配制)洗涤RNA沉淀，

4℃ 5 000 rpm离心5 min;弃上清，室温干燥5 min，加入无核酸酶水20 μL，使充分溶解。

注：也可采用RNA提取试剂盒，选择市售商品化RNA提取试剂盒，按照说明书提取RNA。

7.7 反转录

T/CVMA 232—2025

4

选择市售商品化反转录试剂盒，按照说明书进行反转录，获取cDNA，立即使用可置于冰上进行后

续试验，长期保存于-20℃。

7.8 荧光PCR 检测

7.8.1 引物与探针

荧光PCR反应引物和探针序列见附录C中的C.1，用DEPC水配制成10 μmol/L工作浓度。

7.8.2 反应体系

荧光PCR反应体系见附录C.2。

7.8.3 反应程序

荧光PCR反应程序见附录C.3。反应程序共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，

荧光模式设为FAM/NONE标记模式。

7.9 结果判定

7.9.1 试验结果成立条件：空白对照无Ct 值且无扩增曲线，阴性对照无Ct 值或Ct 值≥40，阳性对照

的Ct 值应≤33，并出现典型的扩增曲线，此次试验有效;否则，此次试验视为无效。

7.9.2 被检样品Ct 值≤35 且出现典型的扩增曲线，判为阳性。当无Ct 值或Ct 值≥40 且无特异性扩

增曲线，判为阴性。当35

版加倍检测，若Ct 值≤35 且出现特异性扩增曲线即判为阳性，否则判为阴性。

T/CVMA 232—2025

5

附 录 A

(规范性)

相关试剂的配制

A.1 0.01 mol/L PBS(pH 7.2)

A.1.1 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液

磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)27.6 g，先用适量蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。

A.1.2 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液

磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)53.6 g(或Na2HPO4·12H2O 71.6 g，或Na2HPO4·2H2O 35.6 g)，先用

适量蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。

A.1.3 0.01 mol/L PBS(pH 7.2)

取0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液14 mL，0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液36 mL，氯化钠8.5 g，调节至pH

7.2，然后用蒸馏水定容至1 000 mL。

A.2 DEPC处理水

DEPC 1 mL，去离子水1 000 mL充分混匀后置于37 ℃放置过夜，高压灭菌。

T/CVMA 232—2025

6

附 录 B

(资料性)

阳性对照质粒的制备

B.1 猪星状病毒五型ORF1a基因片段参考序列(GenBank Accession No.OQ781001.1)

5'-ATGGACAAAGTCTTCAGAAGGGGTGATCCCTTTGCCAGACGGTGGGTTGAAAGCCGTCCT

GAGGTCTATAAATCTATGTTAGACCTGTTTCCTGAGAATGCTGTCATCATGATAACGCGCACCC

GTTACAACTCAGCATTCGCACCTGTAGCTTCCTCTGTTGATGAAGACTCTGAGTGGGTGTCCTAC

GTTTTCACCGGTACTGACTGGGAACAAACGAAAGAAGTCGCGGTCGACTCACAGGCTGCGATCG

TGACTGTGGCACTCTTAGAGAATTCAAAATTGAGGAAACAGAATAAGGAACTACAGTTGCAGAA

TTCTCAGGCGGCACTCGAGTACTCTTTACTTAGGCATGCATATGAAAGAGAAAGGTCTCCACCAC

GCAAGCCTTATGCTTGGTACAAGATCTTCTTCTATGCCTTTGTCTGTGGTGTGCTCTTGTCATCTAT

ACCCACAACAACCGCTTGGCCCGATGGCGACCCTGAAAAGTCTGCCAATCATCCAGTCGCTGGTT

CGTTCTATCCTCATCCATCTGATAGTGACTACCAGCAGTCCTCCTTTACTTTTGACAACTTACGAG

ATCTGCTCACTGACTGGAATAAGAAAGCTTTTAACTACACTCTTTATAGGGATACTTTGTTTAGGG

ACTATCTTACAATTAAGGAGAAAGTTTTAACCTATGAATCCTCACCGATCATATGGTTTTTCCTTG

CAGTTCGACCCTATTGGAGTTTGTGGTTCTTTTCCTCCTTAACCTTTCTTGTTCAGTCCTATGGCAC

CGCTAACTGGCTGGTCGCAAGCCTCATAGTTCTCCTCTCACTCAAGACTGGTGATCGCACTATGG

GCTTATTACCTGTGCCTTGGATGACCACTAGTGGTGCTTGGGTGCACTTGTTCTTAATGGTTATAT

CCCTTTTTGATGTTCTTGGGGCATTCTTTCTATCTTTGCTCTACCTTATTTGTGCACCTATTGTCTAC

TTATGGCAACCTGATGAAACTTTCTTTGTGACTATTAGGAGCTCGACTTTGGTTGCTTTATCCAAT

CTGTTTGCAGTTTTAACACGCAACATTCCTGGTTGTGATATGCTCTGTCTAGCCTTGGTAGTTTGT

TGGCGTGTCCACCAAGCTTGGACTGCCGTTGGTGCCACTCGCTTGGAAATCAAGAATGCAGATGG

TAAAACTACTAAGGTTGTTTCTATGGCACCTAGCTTTTTCCAGCGGGCTAGGCGAAAATTTAGGC

AGGCTGTTAAAAACTTTAGAGCTCCCTCTTTCCCAATACCATCTAACTGCCTGGTACATATCAGCA

CCGACCAAGGTACTGGTACTGGTTTTAGGACAGGCAATTTCATCGTCACTGCTAGGCATGTTGTT

GCTGGTTCTTCTTCAGTGGAGGTGAGTGTTGGTTCCCTCACTACAACTTTGACATCATCTGATTGG

ATACCTCTTGGAGACCGTGATATAGTCAAAGCCAAATTACCATCAGTCTTCCAACATCTTTCTTCT

GTCCGTGTGGCAGAGAAGACTGGGAATGACTGGATTGGGCTTCTGACCTTCGCGGCTAATGGTAG

CTACTACCAATTGGCTGTTGGTGACGGTCTTTGGTTCGATGATACACTCACATATGCACTCGATTC

CGACAATGGATCATCTGGTTCACCAGTGATCGACCGCACAGGTAAGGTTGTTGCAGTGCACACAA

TGTCCACTGGTTACACCGCATCAGGCCAGCGCATCTCACGTGAAGATGTTGAGAATGTCTCCAAG

GTCCAGGAAAAAGATCGTGAAATTGAGAGACTTAAGGCTGAACTTGAGGCTCTAAAAAATCAGT

CCTCCTCAGCTGTGGGTGACCCAGTGTCACCCTTACAGCAGAGTGACCACGATCAAGACCTTGTT

GATCTTGTCCGTGAGGCCGTCAAGCAGGAGATGATCAGGCTTAGATTAGAATTTTCACAGGCCAA

GGGAAAAAACAAACATGGTCGAGGCCGTAAACACAACCTCACCTCAGCAGCACGCAGGATTGGC

AAGCAGTTCACTGAACAAGAGTACCGTAAACTCCAGGAGGAAGGTTGGACCAAGGATGACCTTC

GTGAAATGGCTCTACAACTCTGGGATGAAGCACAAGCCGCAAATGCCGGCTATGGTGAGTGGAG

CGACCCTGAGTGGAGCGACGACGCTTCACTGGGATCAGATTTCTATGAAGAGACCTTGGATCTTG

AACCCCGTGAGTTCGGACAAAAGGCTGAGACTACGGTCACAACTACAAAGAAAACTGGTCCTTT

CCAACAGTGCCAACTCTGTTATCGTGATCCTATGTTGTATGAGGTTGATACTTCTGAGTACAAGAT

T/CVMA 232—2025

7

CTTAGGTGGTCCAATGCATGAGATTTCACGCTATGTTAATGAGCTTCAAGCCTTGCCTCAGGAT

GAGTACACCCGCAAGGCAGTTTATTATTCAAATGCTCTACGGGATGCATGGGATCGCCTTAAT

GCAGAATGTGAACACCGTGGTATACGCCCATTTTCACAGCGCAAAATGAAGCACCCTAGACCA

CGTGCTCAGCCAAAAAACTCCCGGAGGACCCAGCAGACTGGGGCCGGGAAGAAATAA-3'

注：粗体序列为连入pMD18-T载体中构建阳性质粒的引物，粗体下划线为荧光PCR检测引物和探针序列。

B.2 阳性对照质粒的制备

以猪星状病毒五型基因组cDNA 为模板，利用设计的特异性引物进行PCR 扩增，PCR 扩增产物经

1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA 凝胶回收试剂盒回收PCR 产物，连接至pMD18-T 载体构建重组

质粒pMD- PAstV，经菌液PCR 鉴定、测序加以验证。利用紫外分光光度计检测阳性质粒浓度，并按下

面公式将浓度换算成拷贝数，DNA 拷贝数/μL=[6.02×1023×DNA浓度(ng/μL)×10-9](/ DNA碱基数×660)，

经计算并将重组质粒标准品的拷贝数调为1.0×1010 拷贝/μL。即得到猪星状病毒五型阳性对照所需的重

组质粒标准品母液。将母液10 倍系列稀释之后，可作为猪星状病毒五型荧光PCR 检测方法的阳性对照

使用。

用 500 μL TE Buffer(pH 8.0)对pMD- PAstV 质粒进行溶解和10 倍梯度稀释，按本标准建立的方

法测定FAM 通道Ct 值。选择FAM 通道Ct 值在23 ~ 28 之间的稀释倍数作为阳性对照。

T/CVMA 232—2025

8

附 录 C

(规范性)

荧光PCR 检测引物和反应程序

C.1 荧光PCR扩增引物序列

猪星状病毒五型荧光PCR扩增引物序列见表C.1。

表 C.1 荧光 PCR 扩增引物的名称和序列

名称序列(5′- 3′) 扩增片段

PAstV 5 F1 5’-CTTAGGTGGTCCAATGCATGA-3’

PAstV 5 R1 5’-TCCCATGCATCCCGTAGA-3’ 117 bp

PAstV 5 probe FAM-TGAGTACACCCGCAAGGCAGTTTA -BHQ1

C.2 荧光PCR反应体系

猪星状病毒五型荧光PCR 反应体系见表C.2。

表C.2 荧光PCR反应体系

组分 1个检测反应的加入量(μL)

AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 10.0

ddH2O 6.0

PAstV 5 F1(10 μM) 0.5

PAstV 5 R1(10 μM) 0.5

PAstV 5 probe(10 μM) 1.0

cDNA模版2.0

总体积 20.0

C.3 荧光PCR反应程序

猪星状病毒五型荧光PCR 反应程序见表C.3。

表C.3 荧光PCR反应程序

温度 反应时间 循环数

95 ℃ 5 min 1

95 ℃ 10 s

40

60 ℃ 30 s

__________________