T/CVMA 231-2025 猪萨佩罗病毒病诊断技术规范 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
《猪萨佩罗病毒病诊断技术规范》（T/CVMA 231-2025）主要内容总结
1. 范围
本文件规定了猪萨佩罗病毒病（Porcine Sapelovirus Disease, PSV）的临床诊断、实验室检测方法（病毒分离与鉴定、RT-PCR、实时荧光RT-PCR、ELISA）的技术要求，适用于该病的诊断、检疫、监测及流行病学调查。
2. 规范性引用文件
- 主要引用NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》。
3. 术语和定义
无特殊术语需界定。
4. 缩略语
列出常用缩略语（如PCR、ELISA、RNA等）及其全称。
5. 临床诊断
- 流行病学：
- 宿主：家猪和野猪，经粪-口传播，春冬季高发，易与其他肠道病毒混合感染。
- 临床症状：
- 腹泻、肺炎、共济失调、肢体瘫痪（脊髓灰质炎综合征）；母猪繁殖障碍（流产、死胎等）。
- 病理变化：
- 剖检：小肠绒毛萎缩、脑充血、肺泡扩张破裂。
- 组织学：神经细胞空泡化、肺间质充血。
- 结果判定：符合临床症状或病理变化可初步判定为疑似病例，需进一步实验室确诊。
6. 样品采集与处理
- 采样工具：解剖器械、离心管、防护用具等。
- 试剂：PBS、青霉素/链霉素溶液。
- 样品类型：组织（小肠、肺、脑）、粪便、血液。
- 处理方法：研磨、离心、过滤（0.22μm）。
- 保存与运输：4℃保存≤24小时，长期保存需-80℃避免反复冻融。
7. 病毒分离与鉴定
- 方法：
- 使用猪睾丸细胞（ST细胞）接种样品滤液，观察致细胞病变效应（CPE）。
- 若出现CPE（细胞圆缩、脱落），收集病毒液；无CPE需盲传2~3代。
- 结果判定：CPE阳性且RT-PCR或荧光RT-PCR验证为阳性，则判定病毒分离阳性。
8. RT-PCR检测
- 步骤：
- RNA提取：TRIZOL法或试剂盒法。
- 反转录：生成cDNA。
- PCR扩增：使用特异性引物（PSV F1/R1，扩增210 bp片段）。
- 电泳检测：1%琼脂糖凝胶，210 bp条带为阳性。
- 结果判定：阳性对照有条带、阴性对照无条带时，样品出现210 bp条带判为阳性。
9. 实时荧光RT-PCR检测
- 步骤：
- 使用特异性引物（PSV F2/R2）和探针（FAM标记）。
- 反应程序：40个循环（95℃ 5s→60℃ 30s）。
- 结果判定：
- 阳性：Ct≤35且扩增曲线典型。
- 阴性：Ct≥38或无扩增曲线。
- 可疑：35<Ct<38需复检。
10. 间接ELISA检测抗体
- 步骤：
- 抗原包被：PSV-VP1蛋白（1μg/mL）。
- 封闭：BSA封闭非特异性结合。
- 加样：血清样本80倍稀释。
- 酶标抗体：HRP标记抗猪IgG（1:6000）。
- 显色与终止：TMB显色，450 nm测OD值。
- 结果判定：
- 阳性：OD≥0.3（阳性对照OD>1.0，阴性对照OD≤0.2）。
11. 综合判定
- 临床疑似病例需通过实验室任一方法（病毒分离、RT-PCR、荧光RT-PCR或ELISA）阳性确诊。
附录A（试剂配制）
详细列出PBS、细胞培养液、封闭液等配方（如TAE缓冲液、DEPC水等）。
附录B（阳性对照制备）
- 构建含PSV 5'UTR基因片段的重组质粒（pMD-PSV），用于RT-PCR和荧光PCR阳性对照。
附录C（引物与反应条件）
- RT-PCR引物（PSV F1/R1）和荧光PCR引物/探针（PSV F2/R2及FAM探针）序列及反应程序。
附录D（ELISA抗原制备）
- 通过原核表达系统制备PSV-VP1重组蛋白，纯化后作为ELISA包被抗原。
文件特点
- 全面性：涵盖临床诊断、病原检测（分离、分子生物学）和抗体检测（ELISA）。
- 标准化：严格规定试剂配制、操作步骤及结果判读标准。
- 实用性：提供详细的附录（如引物序列、阳性对照制备方法），便于实验室操作。
- 科学性：结合CPE观察、分子检测和血清学方法，确保结果准确性。
该标准为猪萨佩罗病毒病的诊断和防控提供了技术依据，适用于兽医实验室、检疫机构及养殖场。
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