ICS 11.220
CCS B 41 DB42
湖北省地方标准
DB42/T 2384—2025
犬巴贝斯虫病诊断技术
Diagnostic techniques for canine babesiosis
2025 - 06 - 23 发布2025 - 08 - 23 实施
湖北省市场监督管理局 发布
DB42/T 2384—2025
I
目次
前言................................................................................. III
引言................................................................................... V
1 范围................................................................................ 1
2 规范性引用文件...................................................................... 1
3 术语和定义.......................................................................... 1
4 缩略语.............................................................................. 1
5 生物安全要求........................................................................ 2
6 临床诊断............................................................................ 2
7 血涂片显微镜镜检.................................................................... 2
8 PCR 检测方法.........................................................................3
9 抗体检测............................................................................ 5
10 综合判定........................................................................... 6
11 标准实施及评价..................................................................... 6
附录A(资料性) 传播媒介长角血蜱、镰形扇头蜱和血红扇头蜱的鉴定特征....................8
附录B(资料性) 吉氏巴贝斯虫病典型症状及病理变化.....................................10
附录C(规范性) 溶液配制.............................................................11
附录D(资料性) 红细胞内典型虫体形态.................................................13
附录E(资料性) PCR 扩增片段核酸序列................................................. 14
附录F(规范性) P47 基因特异性引物序列............................................... 15
附录G(规范性) PCR 反应体系配置及注意事项........................................... 16
附录H(规范性) PCR 检测质控标准与结果判定图......................................... 17
附录I(资料性) 用于重组抗原制备的SA1 基因片段核酸序列...............................18
附录J(规范性) 吉氏巴贝斯虫SA1 重组抗原的制备.......................................19
附录K(规范性) 标准阴性对照血清的制备...............................................21
附录L(规范性) 标准阳性对照血清的制备...............................................22
附录M(规范性) 抗体检测试纸条的制备.................................................23
附录N(规范性) 抗体检测试纸条检测结果示意图.........................................25
附录O(资料性) 湖北省地方标准实施信息及意见反馈表...................................26
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III
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由华中农业大学提出。
本文件由湖北省农业农村厅归口。
本文件起草单位：华中农业大学、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中
心。
本文件主要起草人：贺兰、赵俊龙、杨心如、李东方、陈方维、王森、周丹娜、杜芬。
本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：
hbsnab@126.com;或者牵头起草单位华中农业大学，电话：027-87280408，邮箱：helan@mail.hzau.edu.cn;
对本文件的有关修改意见建议请反馈至华中农业大学， 电话： 027-87280408 ， 邮箱：
helan@mail.hzau.edu.cn。
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V
引言
犬巴贝斯虫病(canine babesiosis)是由巴贝斯科、巴贝斯属的巴贝斯虫寄生于犬的红细胞内所
引起的蜱传性血液原虫病，患病犬常出现溶血性贫血、发热、黄疸和血红蛋白尿等典型临床症状。该病
在世界范围内广泛传播和流行，我国的犬巴贝斯虫病的主要病原是吉氏巴贝斯虫(Babesia gibsoni)，
在中文文献中也称巴贝虫、巴贝西虫、巴贝西原虫、巴贝斯原虫等。1985年我国南京发现首例犬感染巴
贝斯虫的病例，随后在我国大部分地区均有病例报道。春夏秋季节温度适宜，环境潮湿导致蜱活动增加，
犬在湿润的草地、山地或湿地上玩耍时更容易被蜱叮咬，引起巴贝斯虫感染。至今缺乏有效疫苗和根治
药物，宿主一旦感染终生带虫，因此早诊断对该病的综合防控至关重要。目前国内兽医临床上急性病例
的诊断多采用姬姆萨染色血液涂片的显微镜观察。该方法对检测条件的要求较低，简便快捷，可半小时
内出结果;由于镜检对染虫率低的样本检出率低，需要检测人员有丰富的经验，否则容易出现漏检或误
判，尤其易与泰勒虫混淆。另一方面，由犬巴贝斯虫所引起的隐性感染和既往感染较为常见，需要做实
验室检测。
为了提高犬巴贝斯虫检测的准确性，本文件从各检测方法的检测原理、敏感性和特异性等多方面综
合考虑，制定了一套适用于犬的巴贝斯虫病的多方法联合诊断方案，以期为临床犬巴贝斯虫病的精准诊
断提供依据。
本文件中临床诊断可初步判定患病犬感染巴贝斯虫的潜在可能;血涂片显微镜检测方法用于从活体
动物的外周血液中检测巴贝斯虫;聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)用于巴贝斯虫
核酸检测，可检测当前感染;BgSA1抗体检测试纸条用于检测血清样品中的巴贝斯虫抗体，可用于实验
室检测、流行病学调查和检验检疫。
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1
犬巴贝斯虫病诊断技术
1 范围
本文件规定了犬巴贝斯虫病诊断的生物安全要求、临床诊断、血涂片显微镜镜检、PCR检测、抗体
检测和综合判定的技术要求，描述了病原学和血清学的检测方法和诊断技术要求。
本文件适用于犬巴贝斯虫病的临床诊断、实验室诊断、流行病学调查以及检验检疫。
注：本文件所称犬巴贝斯虫特指吉氏巴贝斯虫。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
GB/T 42011-2022 实验动物福利通则
NY/T 541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
犬巴贝斯虫病canine babesiosis
由巴贝斯虫寄生于犬的红细胞内引起的一种蜱传性血液原虫病，以发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿
为主要特征。
3.2
吉氏巴贝斯虫Babesia gibsoni
吉氏巴贝斯虫属于原生生物，为顶复门、孢子虫纲、梨形虫目、巴贝斯科、巴贝虫属的一种寄生于
犬红细胞内的血液原虫，为小型虫体，大小为1 μm～2 μm，在体内可呈点状、环状、梨籽形。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对(base pair)
DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside triphosphate)
IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
PCR：聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)
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TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸(Tris-acetate-EDTA)
5 生物安全要求
样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作，应遵守GB 19489、GB/T 27401、GB/T 42011-2022
和NY/T 541-2016的相关规定。
6 临床诊断
6.1 流行特点
犬感染吉氏巴贝斯虫引起犬巴贝斯虫病。吉氏巴贝斯虫自然传播主要是通过蜱的叮咬传播，患病犬
的发病大多数情况下与蜱叮咬直接相关，也可通过输血、受污染的设备或经胎盘传播，以及犬只互相撕
咬期间咬伤，通过血液传播。长角血蜱、镰形扇头蜱和血红扇头蜱等是该病原的传播媒介(见附录A)。
犬巴贝斯虫病的发生与动物的性别及年龄相关性不大，任何年龄的犬只均可发病。犬巴贝斯虫病多发于
4月～10月，分布和发病季节往往与蜱的分布和活动季节密切相关。
6.2 典型临床症状
典型临床症状包括但不限于：
——发热：体温升高至40℃～41℃，持续3 d～5 d 后，转至正常，5 d～7 d 后再次升高。即呈
不规则间歇热型;
——贫血：渐进性贫血，可视黏膜苍白、黄染(见附录B);
——血红蛋白尿：尿液颜色深黄或桔红或似浓茶水样(见附录B);
——呕吐：部分病犬有呕吐症状。
6.3 典型病理变化
典型病理变化包括但不限于：
——血液稀薄如水，凝固不良;
——全身皮下脂肪黄染;
——肝脏和脾脏肿大易碎，体积约为正常犬的2 倍～3 倍，甚至3 倍～4 倍(见附录B);
——单侧或双侧肾肿大。
6.4 结果判定
犬出现本文件6.2典型临床症状或者病死犬剖检时有本文件6.3典型病理变化，并符合本文件6.1流
行特点，判为疑似巴贝斯虫病。
7 血涂片显微镜镜检
7.1 基本要求
除特殊说明外，本文件所有操作程序均应符合GB 19489、GB/T 27401、GB/T 42011-2022和NY/T
541-2016的规定。
7.2 试剂耗材
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3
试剂耗材包括但不限于：
——除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682 的要求;
——姬姆萨染液原液，按照附录C 中的方法配制。或使用商品化吉姆萨染液;
——甲醇;
——香柏油;
——载玻片。
7.3 仪器设备
光学显微镜(含100×物镜)。
7.4 血涂片制备
用剪毛剪剪去犬耳尖毛发，揉搓采血部位，使血流旺盛，针头刺破耳尖，挤取一滴耳尖静脉血于载
玻片上，用推片将血液推成薄血涂片，并迅速晾干。
7.5 血涂片固定
加甲醇于血涂片，使甲醇完全覆盖血涂层，待晾干后重复一次。
7.6 血涂片染色
加姬姆萨染液于已固定好的血涂片，使其完全覆盖血涂层。室温条件染色30 min。染色结束之后，
用自来水冲掉染液。将血涂片自然晾干或者吹风机吹干。
7.7 显微镜镜检
在血涂片上滴加一滴香柏油，用光学显微镜在100×镜下观察100个视野。
7.8 结果判定
7.8.1 显微镜镜检阳性
红细胞内观察到典型的吉氏巴贝斯虫(见附录D)形态如圆环形、双梨形等时，判为血涂片显微镜
镜检阳性。
7.8.2 显微镜镜检疑似阳性
犬红细胞内未见典型虫体，但观察到少量点状疑似虫体时(见附录D)，判为血涂片显微镜检查疑
似阳性。
7.8.3 显微镜镜检阴性
未出现本文件7.8.1和7.8.2的结果，判为血涂片显微镜镜检阴性。
8 PCR 检测方法
8.1 基本要求
除特殊说明外，本文件所有操作程序均应符合GB 19489、GB/T 27401、GB/T 42011-2022和NY/T
541-2016的规定。
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8.2 试剂耗材
试剂耗材包括但不限于：
——2×Rapid Taq Master Mix(商品化)包含Taq DNA 聚合酶、dNTP 以及优化的缓冲体系;
——双蒸水;
——全血基因组DNA 提取试剂盒;
——琼脂糖(电泳级);
——1×TAE 缓冲液，按照附录C 中的方法配制;
——GelRed 或其他核酸染料;
——吉氏巴贝斯虫阳性基因组对照(用体外纯培养的吉氏巴贝斯虫，染虫率达到5 %及以上时，收
集样品，提取血液基因组DNA，使用紫外分光光度计测浓度，稀释至1 ng/μL;或序列合成
基因片段(见附录E)作为阳性对照);
——吉氏巴贝斯虫阴性基因组对照(筛选吉氏巴贝斯虫阴性犬，提取血液基因组DNA，使用紫外分
光光度计测浓度，稀释至1 ng/μL);
——核酸分子Marker 2000;
——抗凝真空采血管;
——1.5 mL 无菌离心管;
——200 μL PCR 管;
——10 μL、100 μL、1000 μL 不同规格的微量移液器吸头。
8.3 仪器设备
仪器设备包括但不限于：
——PCR 扩增仪;
——核酸电泳系统;
——单道微量移液器(1 μL～10 μL;10 μL～100 μL;100 μL～1000 μL);
——离心机;
——紫外分光光度计;
——凝胶成像分析系统。
8.4 样品处理
抗凝真空管采集犬静脉血，编号，保存于4℃，送检。
8.5 DNA 提取
用商业化的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，方法按照试剂盒说明书。提取的DNA立即进
行PCR扩增或保存于-20℃备用。
8.6 PCR 反应操作方法
8.6.1 反应体系
扩增吉氏巴贝斯虫P47基因的引物BgF/BgR按照附录F中生物序列合成。配制PCR反应体系，按照附录
G来配制，反应体系总体积为25 μL。吉氏巴贝斯虫阳性DNA为阳性基因组对照，吉氏巴贝斯虫阴性犬血
液基因组为阴性对照。
8.6.2 反应条件
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于200 μL PCR管中配制反应体系，混匀，置于PCR仪上进行扩增。扩增程序为：95℃预变性3 min;
然后95℃变性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸1 min，共扩增35个循环;72℃延伸5 min。
8.7 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳和成像
用1×TAE缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶(配制方法见附录C)，取PCR产物10 μL与2 μL 6×加样缓
冲液混合，加样于含1×GelRed或其他核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶制备的凝胶块中，在1×TAE缓冲液中，
5 V/cm条件电泳30 min，当溴酚蓝达到底部时停止电泳，凝胶成像分析系统观察结果，并拍照保存。
8.8 质控标准
吉氏巴贝斯虫阳性DNA对照出现1071 bp的特异性条带，且阴性对照无扩增条带时，判为试验成立(应
符合附录H的规定)。
8.9 结果判定
8.9.1 阳性
用特异性引物自待检样品基因组DNA中扩增出大小为1071 bp的条带，判定为吉氏巴贝斯虫核酸阳性
(应符合附录H的规定)。
8.9.2 阴性
待检样品无特异性的阳性扩增条带出现，判定为吉氏巴贝斯虫核酸阴性。
9 抗体检测
9.1 基本要求
除特殊说明外，本文件所有操作程序均应符合GB 19489、GB/T 27401、GB/T 42011-2022和NY/T
541-2016的规定。
9.2 试剂耗材
试剂耗材包括但不限于：
——吉氏巴贝斯虫BgSA1 抗体检测试纸条;
——非抗凝真空采血管;
——1.5 mL 无菌离心管;
——10 μL、100 μL、1000 μL 不同规格的微量移液器吸头。
9.3 仪器设备
仪器设备包括但不限于：
——单道微量移液器(1 μL～10 μL;10 μL～100 μL;100 μL～1000 μL);
——离心机;
——恒温水浴锅;
——恒温箱;
——核酸蛋白检测仪;
——细胞破碎仪;
——恒温摇床;
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——制冰机;
——PCR 仪。
9.4 材料准备
吉氏巴贝斯虫SA1碱基序列见附录I，SA1重组抗原按照附录J制备，吉氏巴贝斯虫标准阴性血清按照
附录K制备，吉氏巴贝斯虫标准阳性血清按照附录L制备，吉氏巴贝斯虫抗体检测试纸条按照附录M制备，
其他相关试剂按照附录A配制。
9.5 待检血清样品的处理
静脉无菌采集犬血液1 mL，静置或置37℃中促其凝固，再于2℃～8℃冰箱中放置2 h。4℃ 3000 g
离心10 min，收集上清于1.5 mL离心管中，于-20℃保存或送检。
9.6 操作步骤
取待检血清样品40 μL～60 μL(滴管2滴～3滴)，缓慢加到样品孔中，在样品孔中滴加20 μL
(滴管1滴)抗体稀释液，试纸条上将有红色条带移动。静置15 min，观察结果。
9.7 结果判定
9.7.1 血清抗体阳性
在试纸条上出现两条线(检测线和质控线)(应符合附录N的规定)。
9.7.2 血清抗体阴性
在试纸条上仅出现一条线(质控线)(应符合附录N的规定)。
9.7.3 无效结果
质控线不显示。
10 综合判定
10.1 阳性
出现本文件6.4疑似吉氏巴贝斯虫病判定结果，进一步判定如下：出现本文件7.8中a)项或8.7中a)
项或9.7中a)项结果的，判为吉氏巴贝斯虫病阳性;
10.2 隐性感染
未出现本文件6.4疑似巴贝斯虫病判定结果，进一步判定如下：出现本文件7.8中b)项结果的，判
为吉氏巴贝斯虫隐性感染。
10.3 阴性
未出现本文件6.4疑似巴贝斯虫病判定结果，进一步判定如下：出现本文件7.8中c)项、8.7中b)
项和9.7中b)项结果的，判为吉氏巴贝斯虫感染阴性。
11 标准实施及评价
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11.1 结合本文件包括犬巴贝斯虫诊断技术的实际，各级监督管理层，基于操作层文化程度、监督管理
层操作工艺知识的实际，集合犬巴贝斯虫病诊断技术实操与讲解相结合的培训方法，认真做好标准实施
准备，包括标准实施的方案准备、组织准备、知识准备、手段准备和物质条件准备等。
11.2 制定标准实施方案，明确适用于犬巴贝斯虫诊断技术规程的对象和场景、提供实施必备条件和保
障(组织、制度、资金、人员和设备仪器等)、推荐方法路径，确定资源要素配置、关键环节和控制点，
提出标准实施中的注意事项。
11.3 各级监督管理层了解安全风险特性与应用本标准管控培训需求。在标准颁布实施后的1 个月内组
织标准主要起草人完成标准实施方案制定，并报备标准归口单位备案，同时编制完成标准宣贯讲义;6
个月内，推动标准起草单位中的标准培训，结合标准要求，落实责任制，做到横向到边，纵向到底。
11.4 本文件的实施，为犬巴贝斯虫病诊断提供成套技术标准、为相关技术和管理人员提供实施和管理
的技术手段和方法、落实国家的环境保护、健康、卫生、安全的要求。
11.5 本文件实施检查标准实施方案的落实情况，需要逐条检查标准实施内容的落实，并记录未实施内
容的理由或原因。为此文件起草单位将结合标准宣贯，每季度组织1 次标准实施检查，也要检查标准实
施的支持和物质条件的落实情况。做好标准实施验证记录，畅通标准实施信息采集的方式、方法和反馈
渠道，定期整理并处理收集到的意见建议。依据《中华人民共和国标准化法》落实标准实施评价。
11.6 在本文件实施6 个月后，对照标准实施方案，开展标准实施效果评价分析，总结实施经验成效，
梳理存在的薄弱环节，标准实施的评价主要是评价实施的效果，主要从技术进步、质量水平提高、客户
满意度、规范秩序、效率提高、节约费用、节省时间、履行社会责任等方面进行有益性评价，同时还要
评价标准实施带来的问题，以便为未来改进提供参考，以评价促进标准的持续完善。
11.7 适时向专业标准化技术委员会和标准归口管理单位反馈情况，提出标准推广、修改、补充、完善
或者废止等意见建议。
11.8 标准实施信息及意见反馈表相关示例见附录O。
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附录A
(资料性)
传播媒介长角血蜱、镰形扇头蜱和血红扇头蜱的鉴定特征
A.1 概述
长角血蜱和镰形扇头蜱是吉氏巴贝斯虫重要的传播媒介，在犬上发现这两种蜱感染，可为犬的吉氏
巴贝斯虫病的诊断提供进一步的证据。
A.2 鉴定要点
A.2.1 长角血蜱
雌蜱：体长2.52 mm～3.01 mm，宽1.57 mm～1.75 mm，褐黄色，假头宽短，盾板亚圆形。
雄蜱：体长2.10 mm～2.38 mm，宽1.29 mm～1.57 mm，褐黄色，假头短小，盾板长卵形。
A.2.2 镰形扇头蜱
雌蜱：体长3.29 mm～3.92 mm，宽1.93 mm～2.51 mm，卵圆形，假头基六边形，盾板长略胜于宽。
雄蜱：体长3.94 mm～4.77 mm，宽2.20 mm～2.61 mm，须肢粗短，盾板刻点不均，肛侧板镰刀形。
A.2.3 血红扇头蜱
雌蜱：体长2.8 mm～3.8 mm，宽1.8 mm～2.0 mm，假头基宽短六角形，盾板长胜于宽，赤褐色。
雄蜱：体长3.0 mm～3.8 mm，宽1.6 mm～1.9 mm，假头基六角形，盾板长卵形，气门板匙形。
A.3 形态
长角血蜱形态特征见图A.1，镰形扇头蜱形态特征见图A.2，血红扇头蜱形态特征见图A.3。
标引序号说明：
1——幼蜱;
2——若蜱;
3——雄蜱;
4——雌蜱。
图A.1 长角血蜱形态图
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标引序号说明：
1——雄蜱背面;
2——雄蜱腹面;
3——雌蜱背面;
4——雌蜱腹面。
图A.2 镰形扇头蜱形态图
标引序号说明：
1——雌蜱背面;
2——雌蜱腹面;
3——雄蜱背面;
4——雄蜱腹面。
图A.3 血红扇头蜱形态学特征
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附录B
(资料性)
吉氏巴贝斯虫病典型症状及病理变化
吉氏巴贝斯虫病典型症状及病理变化见图B.1。
标引序号说明：
1——眼结膜黄染(红色箭头所示);
2——皮肤黄染(红色箭头所示);
3——脾脏肿大，边缘钝圆。
图B.1 巴贝斯虫病典型症状及病理变化图
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附录C
(规范性)
溶液配制
C.1 姬姆萨染液储存液
准备33 mL甘油，将0.5 g姬姆萨染料置于研钵中，加少量甘油进行充分研磨，然后加入全部的甘油，
55℃～60℃水浴加热1 h～2 h，期间不断摇动混匀。冷却至室温后加入33 mL甲醇，搅拌混匀，储存在
棕色瓶中室温静置6～12个月，避光保存。
C.2 姬姆萨染液工作液
按每毫升去离子水加200 μL姬姆萨染液原液进行配制。
C.3 TAE 溶液配制方法
C.3.1 50×TAE贮存液
50×TAE贮存液配方如表C.1所示，约800 mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至
1000 mL，常温保存备用。
表C.1 50×TAE 贮存液配方
试剂种类用量
Na2EDTA ·2H2O 37.2 g
冰醋酸57.1 mL
Tris-Base 242 g
C.3.2 1×TAE 使用液
1×TAE贮存液配方如表C.2所示。
表C.2 1×TAE 贮存液配方
试剂种类用量
50×TAE贮存液10 mL
去离子水490 mL
C.4 1.5%的琼脂糖凝胶
1.5%的琼脂糖凝胶配方如表C.3所示。微波炉加热至琼脂糖熔化，待稍冷却后加入GelRed或同类核
酸染料，摇匀。
表C.3 1.5%的琼脂糖凝胶配方
试剂种类用量
琼脂糖干粉1.5 g
1×TAE使用液100 mL
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C.5 His-binding Buffer(pH= 8.0)
1.5%的琼脂糖凝胶配方如表C.3所示，完全溶解后，调pH 值至8.0，加去离子水至1000 mL，4℃存
放备用。
表C.4 His-binging 溶液配方
试剂种类用量
NaCl 17.352 g
Tris-base 1.21 g
NaH2PO4 7.8 g
去离子水900 mL
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附录D
(资料性)
红细胞内典型虫体形态
红细胞内的吉氏巴贝斯虫形态如图D.1所示。
标引序号说明：
1——红细胞内疑似虫体(红色箭头所示);
2——红细胞内圆环状虫体(红色箭头所示);
3——红细胞内双梨形虫体(红色箭头所示)。
图D.1 吉氏巴贝斯虫典型形态图
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附录E
(资料性)
PCR 扩增片段核酸序列
PCR扩增片段P47基因片段序列如图E.1所示。
P47基因片段序列5’-3’
GCCTGTACATCCACAATTGGCTACCTTTCAACAGCAACTTGAATTTGTAGCAAGGTTTGATGAGGCGTTTAATACTGCCGAGGAAGAAT
ATAAGAAGAAACTAGTTCACCTCCTTCCACTTTACAAGGTGAATCCTTTCAAAGACGTCTGGATTCATTTTAAGGAAGGTGTTAAGAAT
GTTGCTGAATTGTATGCTGTGTTACTTCGTGTCCCCCAATCTACAGCAACCCCTGCCGGTACGTTTATATATTCATCGATTCATTACCT
TAGCAGATGAAGAGAGAAAGCCTTCTGCCTCTTTACAGAATCTGTTGGATATCGCTTTAAATGCAACAGGTGATGCTCTGCACATTGCA
GATAAGGCTGTGAAGACTGTCATTGGAATAGAGATAAAGGATGGTGTTTTAAATGCGACGCTTGAAAATGCTGAGCTTCTGTCTGAAGT
CCTGCCGGAGTTCTTTGAAAAACTTTTGGAGTTCAAAAAGGTGGTTGAGGATGCGTATGCCCCTGAATCCCAAGTTGATGGTGGTAAGT
TATTCACACGACTTGGTCACAGCCCCGTTGAACCCTACTTGAAGAATCACGGTTTCAAAGATGGAGATTTTAAACGTGAAGCTTCATTA
AAAGATTTGAGAAAGAAACTTATAGAGCTAGTTGACACTGGTAAGCATTTTCAGGAGGTCCTGGGCGTGCTTGCCGCAGATGCACTTAT
GCGAACTCCAGATGGCCCAATGAGAAAACAAGCATGGCTCTTTTTATTGTCAAGTACAATGCATAACGAAGCTATGAAGGAGAGGCTTA
AGGATGCCGTAAACAAAGTAACCGGTAAAGGAGATACCTTTGTAGAGGAACTGAAGAAACTGGGACCACAAATTAAGCTTCCCAAGGAA
AAGACTCCCAAAGGATACCTTTTCCCCGGTGAATATGTAAACTGCGATGTTCATCACTTCTGGACTGTGTTAACTGGGGTATTTGGTAC
CATACTTGACGATATAAGTAAAGCGGCCCCCACTGCAAAAACTGGAGGGGGTGTTGTCCCCCAGGAGTTAGCTGACCTTGTCAAGGTGC
AAG
图E.1 PCR 扩增片段P47 基因片段序列
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附录F
(规范性)
P47 基因特异性引物序列
采用PCR方法开展巴贝斯虫检测时，需合成扩增P47基因的引物见表F.1。
表F.1 吉氏巴贝斯虫P47 基因特异性引物序列
引物类型引物名称引物序列扩增长度
正向引物BgF GCCTGTACATCCACAATTGGCTACC
1071 bp
反向引物BgR CTTGCACCTTGACAAGGTCAGCTAAC
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附录G
(规范性)
PCR 反应体系配置及注意事项
G.1 反应体系配制
每个PCR反应体系包括的组分见表G.1。
表G.1 PCR 反应体系
组成成分加样体积/μL 总体积/μL
2 ×Rapid Taq Master Mix 12.5
25
BgF(10 μM) 1
BgR(10 μM) 1
DNA 1
ddH2O 9.5
G.2 注意事项
G.2.1 在配制PCR反应体系过程中，阳性对照DNA与待检样品DNA应该在不同区域添加，以免造成污染。
G.2.2 所有试剂应按照要求分别在4℃或-20℃条件保存，使用时在室温条件下融化，混合均匀，放置
于冰上。
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附录H
(规范性)
PCR 检测质控标准与结果判定图
H.1 P47 基因特异性引物扩增质控标准
用吉氏巴贝斯虫P47基因特异性引物，仅可自吉氏巴贝斯虫阳性基因组中扩增出大小约为1071 bp
的片段(见图H.1)。
标引序号说明：
M——核酸分子Marker
1——吉氏巴贝斯虫阳性基因组对照
2——吉氏巴贝斯虫阴性基因组对照
图H.1 吉氏巴贝斯虫特异性引物扩增质控标准图
H.2 吉氏巴贝斯虫P47 基因特异性引物检测结果
用吉氏巴贝斯虫P47基因特异性引物，自待检样品基因组中扩增出大小约为1071 bp的片段(见图
H.2)。
标引序号说明：
M——核酸分子Marker
1——吉氏巴贝斯虫阳性基因组对照
2——待检样品
3——吉氏巴贝斯虫阴性基因组对照
图H.2 吉氏巴贝斯虫特异性引物检测的阳性样品结果图
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附录I
(资料性)
用于重组抗原制备的SA1 基因片段核酸序列
用于重组抗原制备的SA1基因片段核酸序列见图I.1。
SA1基因片段序列5’-3’
ACACAAATAACAACACCTGTGGATGACAATGATTCTGCTCCAATGGAGCCACATTCTGTCAAAGATATGTTACACTTCCTAGGTAAATT
GCAGCAGGACACAAACCTGAAAGAAAAGTTTGTCAATGAACTGGAGAAGGTAGTTAAGGAGTATCTGGACACCACGCAAGTTGAGAAAA
AAGGGTATACTGCTAATTTCGATAGTTTGTTGGAACACGTGAATAAACTACGTCATGAGCTGTTGAACGACACCGGTGATTATGGAAAA
TTTAAGGATCTTAACGAAGAGGGTGTGACAAAGGCTTTTGAAATACTTGTCCAGTGGATTCCAATCTTGCACAGTGAGTTTTCGTTGCT
GTATTTCCTCTCCTCTACGGAGGGACAAGGTATTGGCGGAAATCAATGGATTGAACAATATTTCGGACCAGAGCATACAGGTACACAGG
CACACAAGTGGTTGACTGATAAGTTAAATGAAGCTAAGGACCCTTTCACTGTGAAGAAAGGTTTTGAGGATGGTGATCTAAAACGAGGT
GGTAGGATTACCGCAGCTGTGACTGGTAATCTGGGAATAAACTACTATTCCGGCGGACCTCTAAACTACATGCAATATGGACTGTTTTT
CCTTTCTGGTGATACTTTGCTAGCTGCGAATCTTGCAAGCGCCCTTCTATTCCTGGCAGAGTTCTGTAGGGAAGTAAGTGAGAACAAGT
TTCCCGAGAAGACCACGCTTGATAAATATAAATGTCTTAAGGATGTATGCAAGGATGTAAAAGATAAAATTGATGCTTTTCATAAGCAT
ATTTTGCCTCTATATAATCCTTTAACGGTTGAAGACATAGAAGGTGATGACGATAGTAAACTTGGTGAGGTTGTACGCATGGCGGAGGG
TAGGTGTAATGAAATGTACAAAGGAAAGTTAAAAAAAGAGAAATTTGACGAATATGTCACATGGATGAAAAGGAATCTTGCAAAACTTA
TGCTTCTGCTGAGGGAGATGCACACTGACTCTGCCAGATGGACTGTTGAAGATTTAATGTATGTCCAGTCTCATGGACCATCCAAATAC
GGTTATACGTTCGTGGATAAGAGATGGGATACAAGTATATATTTCACATTTAAGCAGTCTATAGAAGACCTTGCACTTTTTGAATCAAG
CAATGGTCTTTTTAGTCTGCTTAGGTGCTTAGATGGCCAGAGGGCATTAAGAGAGAGGGAAGTCTTTGAAAAATTAGAAGAAGAAAAGA
AAAAGAAAGAAGAGGCTAATAAAAAAGTAAGACGGGTAGCTAAACCAGCAACTGAGGTTGGAGAAGGAGAGGGGAATTCGTCAGGAAAA
CAGACACCAGTTCCTACACCACCCACTGGTAAGACCCAGTTGAAGGAACAAACACTTGCGGATGGTCATTCTGAAGATCCAAAACACAA
GGGTGCAACTAAGCAGACCTCTGAAACCGTTCCACCTGCTCACCAAACAACAGCAAAAGGACCTCCAACAGAAAATGAGGCAGGCCATA
AGGCATCAAAGCCAAATGAAACTGAGTCTAACAAGGCAGAAGGGGTTCCTAAGAAGGAAGAGGAAGTGCCTCAAGAAGGAAAAGGAGAT
GAGAAAGGTGTCCATACCTCCGTTAAAGCAAAGGCGGAAGGCACAGCGAATGAGGCATCATTCTCTGCTTACTCAGTGAGAGTGGCCAC
AGCATTTTTGGCCCTTTTGTCTGTAATGTAA
图I.1 SA1 基因片段核酸序列
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附录J
(规范性)
吉氏巴贝斯虫SA1 重组抗原的制备
J.1 器械与设备
单道微量移液器(1 μL～10μL;10 μL～100 μL;100 μL～1000 μL )、离心机、恒温水浴
锅、恒温箱、核酸蛋白检测仪、细胞破碎仪、恒温摇床、制冰机、PCR仪。
J.2 材料
引物ExpSA1-F / ExpSA1-R(20 μmol/L)， BamH I和Xho I限制性内切酶，T4 DNA连接酶，琼脂
糖凝胶DNA回收试剂盒，克隆载体pETASY-Blunt，表达载体pET-28a，感受态大肠杆菌DH5α，感受态大
肠杆菌BL21(DE3)，卡那霉素，异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，His标签蛋白纯化试剂盒，
LB培养基，一次性针头滤器(孔径0.45 μm)，蛋白浓缩管。
J.3 引物序列
扩增吉氏巴贝斯虫SA1基因表达片段的引物序列见表J.1，ExpSA1-F和ExpSA1-R引物对扩增吉氏巴贝
斯虫SA1表达片段大小为1719 bp。
表J.1 扩增吉氏巴贝斯虫SA1 基因表达片段的引物
目的基因引物序列(5'-3') 酶切位点
SA1
ExpSA1-F GGATCCACACAAATAACAACACCTG BamH I
ExpSA1-R CTCGAGTTACATTACAGACAAAAGGG Xho I
J.4 表达载体的构建和鉴定
J.4.1 吉氏巴贝斯虫表达片段的扩增
引物用ExpSA1-F和ExpSA1-R，DNA模板用吉氏巴贝斯虫标准阳性基因组DNA，反应体系为25 μL，加
样比例见附录G中G.1，反应条件为95℃预变性3 min，95℃变性15 s，53℃退火20 s，72℃延伸1 min，
共35个循环;72℃延伸5 min，15℃保温。扩增结束后，用商品化琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收合
适大小的PCR产物。
J.4.2 双酶切
用20 μL酶切体系：J.4.1回收的10 μL 吉氏巴贝斯虫SA1基因PCR产物或pET-28a质粒，10×酶切
缓冲液2 μL，BamH I和Xho I各1 μL，ddH2O 6 μL，37℃酶切30 min～60 min。并回收酶切产物。
J.4.3 重组质粒的构建与转化
用20 μL连接体系：J.4.2酶切回收的吉氏巴贝斯虫SA1基因片段9 μL，双酶切回收的质粒pET-28a
片段3 μL，T4 DNA连接酶1 μL，10×连接缓冲液2 μL，ddH2O 5 μL。25℃水浴连接40 min。将连接
产物转化到感受态大肠杆菌DH5α，操作步骤根据说明书进行。
J.4.4 阳性菌株的鉴定
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将J.4.3筛选的阳性菌液送相关公司测序，测序结果正确的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞用于重
组抗原表达。
J.5 蛋白表达和纯化
J.5.1 取J.4.4吉氏巴贝斯虫SA1阳性菌株菌液，按1：100的比例接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB培养
基中，37℃ 180 rpm振荡培养至菌液OD600为0.6～0.8。加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，37℃振荡培
养4 h。
J.5.2 将诱导培养的菌液分装到离心管中，在4℃下8000 rpm离心10 min，弃上清液。
J.5.3 沉淀用His-binding Buffer(配制方法见附录C)重悬到50 mL 离心管中。将离心管垂直置于碎
冰，于4℃，1000 bar压力破碎仪上破碎3～5次。
J.5.4 将J.5.3压力破碎的菌体裂解物在4℃以12000 rpm离心10 min，取上清液用0.45 μm 滤器过滤。
滤过液用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白。
J.5.5 将纯化后的蛋白溶液装入处理好的透析袋中，用PBS(pH 7.5)在4℃透析4 h～5 h，重复该透
析步骤3次。
J.5.6 将透析后的蛋白转入蛋白浓缩管，于4℃ 4000 rpm离心，用核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，待
浓缩管中蛋白浓度大于1 mg/mL时停止离心。
J.5.7 浓缩的重组蛋白分装于1.5 mL离心管，每支1.0 mL，置于-20℃保存。
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附录K
(规范性)
标准阴性对照血清的制备
K.1 实验动物选择
选取健康无病原感染的比格犬，按照6和7的要求进行血涂片检查和PCR检测，两种方法均为阴性时
符合要求。
K.2 血清抗体检测
采集符合K.1要求的犬耳尖静脉血1 mL，分离血清。以附录M制备的BgSA1抗体检测试纸条，检测犬
血清中抗吉氏巴贝斯虫的抗体。当出现9.7中b项结果时符合要求。
K.3 标准阴性血清的收集
将符合K.2要求的犬颈动脉放血至死亡，无菌收集全部血液，或采集需要量的静脉血，分离血清。
该血清即为标准阴性对照血清，分装于不同规格的血清瓶或离心管，置于-20℃冰箱保存备用。
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附录L
(规范性)
标准阳性对照血清的制备
L.1 实验动物选择
选择符合K.1和K.2要求的犬，用于制备吉氏巴贝斯虫标准阳性对照血清。
L.2 吉氏巴贝斯虫感染
将已知染虫率的吉氏巴贝斯虫培养物进行2800×g 2 min离心，取下层107个染虫红细胞于无菌EP管
中，加入1 mL生理盐水混匀。选择符合L.1要求的比格犬，进行保定，随后对注射位点消毒，将含107
个染虫红细胞的混合液于背部分5～6点进行皮下注射。
L.3 抗体检测
攻虫后每天定时检测感染犬体温，5 d～7 d后采耳尖血制作血涂片，姬姆萨染液染色后镜检计算染
虫率。14 d后采集犬静脉血1 mL，分离血清。用BgSA1抗体检测试纸条，检测L.2分离的感染前血清和感
染后血清中的吉氏巴贝斯虫抗体。当感染前血清出现8.7中b项结果，感染后血清出现8.7中a项结果时符
合要求。
L.4 标准阳性血清收集
将符合L.3要求的犬颈动脉放血至死亡，无菌收集全部血液，或采集需要量的静脉血，分离血清。
该血清即为吉氏巴贝斯虫标准阳性对照血清，分装于不同规格的血清瓶或离心管，置于-20℃冰箱保存
备用。
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附录M
(规范性)
抗体检测试纸条的制备
M.1 SA1 重组抗原的制备
见附录J。
M.2 单克隆抗体羊抗鼠IgG 制备
羊抗鼠IgG：用纯化的鼠免疫球蛋白免疫山羊后，取羊的B淋巴细胞，利用杂交瘤技术，通过细胞融
合，筛选制成羊抗鼠抗体。该抗体用于胶体金试纸条硝酸纤维素膜(NC膜)的质控线，以此检验试纸条
的有效性。
M.3 单克隆抗体鼠抗犬IgG 制备
鼠抗犬IgG：用纯化的犬免疫球蛋白免疫小鼠后，取小鼠的B淋巴细胞，利用杂交瘤技术，通过细胞
融合，筛选制成鼠抗犬抗体。该抗体可与金标抗原-吉氏巴贝斯虫抗体复合物结合，形成夹心抗原抗体
复合物，用于胶体金试纸条硝酸纤维素膜(NC膜)的捕获。
M.4 金标抗原制备
用氯金酸制备40 nm胶体金颗粒，将SA1重组抗原与胶体金颗粒按照10 μg/mL进行标记，标记完后
用配方为2% Tris，4% Casein的封闭液进行封闭。标记好的金标抗原用高速离心法进行纯化，去除游离
抗原和蛋白及其他小分子物质。沉淀采用0.242% Tris，1% BSA的复溶液重悬，置2℃～8℃保存。
M.5 胶体金结合垫制备
将重选好的金标记抗原溶液从冰箱中取出恢复至室温，用辅料切条机将玻璃纤维素膜切成
(8.5cm×30cm)的规格，将制备的金标记抗原喷涂于切好的玻璃纤维素膜条上，37℃烘箱烘12h～18h，
即制成胶体金结合垫。
M.6 胶体金样品垫制备
样品垫浸泡于0.6% Tris，0.5% Casein，1% PVP30，1% S9，0.5% Toween-80，0.3% EDTA的处理液
中，在45℃的烘箱中烘干12 h～18 h，切成15 mm宽度，即制成胶体金样品垫。
M.7 试剂条板制备
将处理好的胶体金样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫纸按顺序依次粘贴在试
剂条板上。吸水垫与硝酸纤维素膜(NC膜)应重叠2 mm～3 mm，胶体金结合垫搭在硝酸纤维素膜(NC
膜)上重叠1 mm～2 mm，胶体金样品垫搭在胶体金结合垫上重叠2 mm～5 mm，制成试纸条板。
M.8 NC 膜喷样
在制备好的试纸条板的NC膜上分别喷涂捕获抗体(鼠抗犬IgG抗体)和质控抗体(羊抗鼠IgG抗体)，
线宽1 mm，喷完后在45℃的烘箱中烘干12 h～18 h。
M.9 试剂条板切条和试纸条组装
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将NC膜喷有抗体的试纸条板切成3.5 mm (±0.2 mm)宽的试纸条放入塑料卡壳内，立即放入内置干
燥剂的铝箔袋内封口。
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附录N
(规范性)
抗体检测试纸条检测结果示意图
抗体检测试纸条检测结果见图N.1。
标引序号说明：
1——吉氏巴贝斯虫抗体阳性;
2——吉氏巴贝斯虫抗体阴性。
图N.1 BgSA1 抗体检测试纸条检测结果示意图
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附录O
(资料性)
湖北省地方标准实施信息及意见反馈表
湖北省地方标准实施信息及意见反馈表如表O.1所示。
表O.1 湖北省地方标准实施信息及意见反馈表
标准名称及编号
总体评价
适用性该标准与当前所在地的产业或社会发展水平是否相匹配? 是否
协调性
该标准的特色要求与其他强制性标准的主要技术指标、相关
法律法规、部门规章或产业政策是否协调?
是否
执行
情况
标准执行单位或人员是否按照标准要求组织开展相关工作? 是否
实施信息
标准实施过程中是否存在阻力和障碍? 是否
实施过程中存在的主要问题
修改意见
总体
意见
适用修改废止
具体修
改意见
需修改章节：
具体修改意见：
反馈渠道
标准化行政主管部门
省直行业主管部门
专业标准化技术委员会(工作组)
标准起草组(牵头起草单位)
反馈人姓名： 单位： 联系方式：
填表说明：为及时掌握标准实施情况，了解地方标准实施过程中存在的问题，并为标准复审提供科学依据，特制定
《湖北省地方标准实施信息及意见反馈表》。可根据实际情况在表格中对应方框打勾，有需要文字说明的反馈意见可在
相应位置进行文字描述，也可另附页。
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