NY/T 4630-2025 牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
以下是对NY/T 4630-2025《牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法》主要内容的详细总结:
一、标准基本信息
- 标准号:NY/T 4630-2025
- 发布日期:2025年1月9日
- 实施日期:2025年5月1日
- 归口单位:全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)
- 起草单位:
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室(北京)等7家机构。 - 适用范围:
- 第一法(反相液相色谱法):生牛乳、巴氏杀菌牛乳。
- 第二法(凝胶渗透色谱法):高温杀菌牛乳、灭菌牛乳、牛乳粉、牛乳基婴幼儿配方乳粉。
- 定量限:
样品类型 α-乳白蛋白 β-乳球蛋白 生乳/巴氏乳 25 mg/kg 100 mg/kg 高温杀菌乳/灭菌乳 50 mg/kg 100 mg/kg 乳粉/婴幼儿配方乳粉 250 mg/kg 500 mg/kg - 核心限制:仅适用于未变性的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白测定。
二、方法原理
第一法:反相液相色谱法
- 样品前处理:
- 样品用水溶解,调节pH至4.60,沉淀酪蛋白和变性乳清蛋白。
- 离心后取上清液稀释,过膜待测。
- 分离检测:
- 采用 C₄色谱柱(250 mm×4.6 mm, 3.5 μm),紫外检测器(210 nm)。
- 流动相:
- A相:0.1%三氟乙酸水溶液
- B相:0.1%三氟乙酸乙腈溶液
- 梯度洗脱(35分钟程序,乙腈比例5%→60%→5%)。
- 定量:外标法,β-乳球蛋白以A、B两峰面积之和计算。
第二法:凝胶渗透色谱法
- 样品前处理:
- 调节pH至4.60沉淀杂质,离心取上清液。
- 加入盐酸胍缓冲液(pH 7.5)和β-巯基乙醇,室温静置2小时,还原二硫键生成单体蛋白。
- 分离检测:
- 采用二醇基亲水硅胶柱(300 mm×4.6 mm, 2 μm),紫外检测器(280 nm)。
- 流动相:盐酸胍缓冲液(含磷酸盐、EDTA,pH 7.5)。
- 等度洗脱,流速0.18 mL/min。
- 定量:外标法,α-乳白蛋白与β-乳球蛋白独立定量。
三、关键试剂与仪器
通用要求
- 水:GB/T 6682一级水。
- 标准品:α-乳白蛋白(CAS 9051-29-0)、β-乳球蛋白(CAS 9045-23-2),纯度≥95%。
- 滤膜:0.22 μm水系滤膜。
方法特异性试剂
- 第一法:三氟乙酸、乙腈(色谱级)、乙酸(优级纯)。
- 第二法:盐酸胍、β-巯基乙醇、磷酸盐缓冲液(含EDTA)。
仪器设备
- 通用设备:
高效液相色谱仪(配紫外/二极管阵列检测器)、离心机(≥12,000 r/min)、pH计(±0.01精度)、涡旋混合器。 - 色谱柱:
- 第一法:C₄反相柱(300 Å孔径)。
- 第二法:凝胶渗透色谱柱(亲水硅胶)。
四、样品处理流程
生乳/巴氏乳(第一法)
- 称取5 g样品,加水混匀,乙酸调pH=4.60±0.05。
- 定容至25 mL,静置10分钟,12,000 r/min离心10分钟。
- 取1 mL上清液稀释至5 mL,过膜上机。
高温乳/灭菌乳(第二法)
- 称取12.5 g样品,加水混匀,盐酸调pH=4.60±0.05。
- 定容至25 mL,静置2小时,离心取1 mL上清液。
- 加3 mL盐酸胍缓冲液和50 μL β-巯基乙醇,定容至5 mL,静置2小时后过膜。
乳粉/婴幼儿乳粉(第二法)
- 称取2.5 g样品,加水20 mL溶解,调pH=4.60±0.05。
- 后续步骤同高温乳处理。
五、定量与数据处理
- 标准曲线:
- 第一法:1–200 mg/L(7个浓度点)。
- 第二法:5–600 mg/L(6个浓度点)。
- 要求相关系数 R² ≥ 0.99。
- 计算公式:
\omega_i = \frac{\rho_i \times V_{\text{定容}} \times V_{\text{样液}} \times 1000}{m_{\text{样品}} \times V_{\text{上清}} \times 1000} \times f
\omega_i
:含量(mg/kg);\rho_i
:曲线测得浓度(mg/L);f
:稀释倍数。
- 结果表示:平行测定两次,取算术平均值,保留3位有效数字。
六、质量控制要求
- 定性确认:
样品峰保留时间与标准溶液偏差≤±2.5%。 - 精密度:
平行测定结果的绝对差值≤算术平均值的 10%。 - 附录图谱:
- 附录A:反相色谱图(β-乳球蛋白分A、B双峰)。
- 附录B:凝胶渗透色谱图(β-乳球蛋白为单峰)。
七、关键注意事项
- 方法选择:
巴氏乳/生乳用第一法;高温处理产品或乳粉用第二法(需还原变性蛋白)。 - 时效性:
生乳/巴氏乳需立即测定;乳粉可常温密闭保存。 - 试剂现配:
三氟乙酸溶液、盐酸胍缓冲液、含巯基乙醇的处理液需临用现配。
总结
该标准针对不同乳制品特性制定了两套HPLC检测方案:
- 第一法:操作简捷,适用于未变性蛋白的液态乳。
- 第二法:通过化学还原处理,解决高温/粉状样品中蛋白变性导致的检测难点。
标准内容覆盖原理、试剂、仪器、步骤、计算及质控全流程,兼顾科学性与实操性,为乳品质量评估提供了权威技术依据。
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