NY/T 4630-2025 牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法

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资源简介

以下是对NY/T 4630-2025《牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法》主要内容的详细总结:


​一、标准基本信息​

  • ​标准号​​:NY/T 4630-2025
  • ​发布日期​​:2025年1月9日
  • ​实施日期​​:2025年5月1日
  • ​归口单位​​:全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)
  • ​起草单位​​:
    中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室(北京)等7家机构。
  • ​适用范围​​:
    • ​第一法(反相液相色谱法)​​:生牛乳、巴氏杀菌牛乳。
    • ​第二法(凝胶渗透色谱法)​​:高温杀菌牛乳、灭菌牛乳、牛乳粉、牛乳基婴幼儿配方乳粉。
  • ​定量限​​:
    样品类型 α-乳白蛋白 β-乳球蛋白
    生乳/巴氏乳 25 mg/kg 100 mg/kg
    高温杀菌乳/灭菌乳 50 mg/kg 100 mg/kg
    乳粉/婴幼儿配方乳粉 250 mg/kg 500 mg/kg
  • ​核心限制​​:仅适用于​​未变性​​的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白测定。

​二、方法原理​

​第一法:反相液相色谱法​

  1. ​样品前处理​​:
    • 样品用水溶解,调节pH至4.60,沉淀酪蛋白和变性乳清蛋白。
    • 离心后取上清液稀释,过膜待测。
  2. ​分离检测​​:
    • 采用 ​​C₄色谱柱​​(250 mm×4.6 mm, 3.5 μm),紫外检测器(210 nm)。
    • 流动相:
      • A相:0.1%三氟乙酸水溶液
      • B相:0.1%三氟乙酸乙腈溶液
    • 梯度洗脱(35分钟程序,乙腈比例5%→60%→5%)。
  3. ​定量​​:外标法,β-乳球蛋白以A、B两峰面积之和计算。

​第二法:凝胶渗透色谱法​

  1. ​样品前处理​​:
    • 调节pH至4.60沉淀杂质,离心取上清液。
    • 加入​​盐酸胍缓冲液(pH 7.5)和β-巯基乙醇​​,室温静置2小时,还原二硫键生成单体蛋白。
  2. ​分离检测​​:
    • 采用​​二醇基亲水硅胶柱​​(300 mm×4.6 mm, 2 μm),紫外检测器(280 nm)。
    • 流动相:盐酸胍缓冲液(含磷酸盐、EDTA,pH 7.5)。
    • 等度洗脱,流速0.18 mL/min。
  3. ​定量​​:外标法,α-乳白蛋白与β-乳球蛋白独立定量。

​三、关键试剂与仪器​

​通用要求​

  • ​水​​:GB/T 6682一级水。
  • ​标准品​​:α-乳白蛋白(CAS 9051-29-0)、β-乳球蛋白(CAS 9045-23-2),纯度≥95%。
  • ​滤膜​​:0.22 μm水系滤膜。

​方法特异性试剂​

  • ​第一法​​:三氟乙酸、乙腈(色谱级)、乙酸(优级纯)。
  • ​第二法​​:盐酸胍、β-巯基乙醇、磷酸盐缓冲液(含EDTA)。

​仪器设备​

  • ​通用设备​​:
    高效液相色谱仪(配紫外/二极管阵列检测器)、离心机(≥12,000 r/min)、pH计(±0.01精度)、涡旋混合器。
  • ​色谱柱​​:
    • 第一法:C₄反相柱(300 Å孔径)。
    • 第二法:凝胶渗透色谱柱(亲水硅胶)。

​四、样品处理流程​

​生乳/巴氏乳(第一法)​

  1. 称取5 g样品,加水混匀,乙酸调pH=4.60±0.05。
  2. 定容至25 mL,静置10分钟,12,000 r/min离心10分钟。
  3. 取1 mL上清液稀释至5 mL,过膜上机。

​高温乳/灭菌乳(第二法)​

  1. 称取12.5 g样品,加水混匀,盐酸调pH=4.60±0.05。
  2. 定容至25 mL,静置2小时,离心取1 mL上清液。
  3. 加3 mL盐酸胍缓冲液和50 μL β-巯基乙醇,定容至5 mL,静置2小时后过膜。

​乳粉/婴幼儿乳粉(第二法)​

  1. 称取2.5 g样品,加水20 mL溶解,调pH=4.60±0.05。
  2. 后续步骤同高温乳处理。

​五、定量与数据处理​

  • ​标准曲线​​:
    • 第一法:1–200 mg/L(7个浓度点)。
    • 第二法:5–600 mg/L(6个浓度点)。
    • 要求相关系数 ​​R² ≥ 0.99​​。
  • ​计算公式​​:
    \omega_i = \frac{\rho_i \times V_{\text{定容}} \times V_{\text{样液}} \times 1000}{m_{\text{样品}} \times V_{\text{上清}} \times 1000} \times f

    • \omega_i:含量(mg/kg);\rho_i:曲线测得浓度(mg/L);f:稀释倍数。
  • ​结果表示​​:平行测定两次,取算术平均值,保留3位有效数字。

​六、质量控制要求​

  1. ​定性确认​​:
    样品峰保留时间与标准溶液偏差≤±2.5%。
  2. ​精密度​​:
    平行测定结果的绝对差值≤算术平均值的 ​​10%​​。
  3. ​附录图谱​​:
  • 附录A:反相色谱图(β-乳球蛋白分A、B双峰)。
  • 附录B:凝胶渗透色谱图(β-乳球蛋白为单峰)。

​七、关键注意事项​

  1. ​方法选择​​:
    巴氏乳/生乳用第一法;高温处理产品或乳粉用第二法(需还原变性蛋白)。
  2. ​时效性​​:
    生乳/巴氏乳需立即测定;乳粉可常温密闭保存。
  3. ​试剂现配​​:
    三氟乙酸溶液、盐酸胍缓冲液、含巯基乙醇的处理液需临用现配。

​总结​

该标准针对不同乳制品特性制定了两套HPLC检测方案:

  • ​第一法​​:操作简捷,适用于未变性蛋白的液态乳。
  • ​第二法​​:通过化学还原处理,解决高温/粉状样品中蛋白变性导致的检测难点。
    标准内容覆盖原理、试剂、仪器、步骤、计算及质控全流程,兼顾科学性与实操性,为乳品质量评估提供了权威技术依据。

 

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  • 本文由 发表于 2025年7月2日 10:16:34
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