T/CIQA 112-2025 动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法 CRISPR法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
团体标准 T/CIQA 112-2025《动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法 CRISPR法》主要内容总结
1. 范围
- 本标准规定了基于CRISPR技术对动物源性食品（如肉类）中牛、羊和猪源性成分的定性检测方法。
- 适用于食品中上述物种成分的筛查，不涉及定量分析。
2. 规范性引用文件
- 引用多项国家标准和行业标准，包括：
- GB/T 6682（实验室用水要求）
- GB/T 27403-2008（食品分子生物学检测质量控制）
- GB/T 24777-2009（实验室安全要求）
- SN/T 5624-2023（检测实验室风险管理）
3. 缩略语
- 关键术语解释：
- CRISPR：规律间隔成簇短回文重复序列（基因编辑技术核心）。
- crRNA：引导Cas12a酶靶向切割的RNA序列。
- RPA：重组酶聚合酶扩增（用于快速核酸扩增）。
4. 检测原理
- RPA扩增：针对牛、羊、猪的线粒体细胞色素b（cytb）基因设计特异性引物，扩增目标DNA片段。
- CRISPR切割：使用Cas12a酶和crRNA识别扩增产物，切割后释放荧光信号（探针：FAM-BHQ1）。
- 荧光检测：通过酶标仪（494-525 nm）读取荧光增量，判定物种成分是否存在。
5. 试剂与材料
- 关键试剂：
- 裂解液（含CTAB、Tris-HCl等，用于DNA提取）。
- RPA试剂盒（含扩增缓冲液、醋酸镁）。
- Cas12a酶（商业化产品，如NEB的EnGen® Lba Cas12a）。
- 特异性引物、crRNA及荧光探针（序列详见表1）。
- 对照设置：需包含空白对照（水）、阴性对照（不含目标物种的样品）、阳性对照（含目标物种的样品）。
6. 仪器与耗材
- 主要设备：酶标仪、恒温水浴锅、离心机、微量移液器、涡旋振荡器。
7. 样品制备
- 取样50 mg肉类组织，-20℃保存或立即提取DNA。
- DNA提取步骤：
- 裂解（65℃, 30 min）→ 离心取上清。
- 氯仿/异戊醇抽提→异丙醇沉淀→乙醇洗涤→溶解DNA。
8. 实验步骤
- RPA扩增（37℃, 20 min）：
- 体系含引物、DNA模板、RPA缓冲液、醋酸镁。
- CRISPR反应（37℃, 30 min）：
- 体系含Cas12a、crRNA、荧光探针、RPA产物。
- 荧光检测：酶标仪读取10 min和2 min的荧光值，计算判定值N。
9. 结果计算与判定
- 公式：
N = \frac{\text{10 min样品荧光值/对照荧光值}}{\text{2 min样品荧光值/对照荧光值}} - cut-off值：
- N ≥ 1.40：阳性（检出目标物种）。
- N ≤ 1.20：阴性（未检出）。
- 1.20 < N < 1.40：需复测。
10. 质量控制
- 空白对照：无荧光增长。
- 阴性/阳性对照：需符合预期结果，否则实验无效。
11. 结果报告
- 阴性样品：报告“未检出”。
- 阳性样品：需确证后报告“检出”。
12. 防污染措施
- 按GB/T 27403-2008要求，防止PCR产物交叉污染（如分区操作、耗材灭菌）。
附录A（资料性）
- 提供牛、羊、猪的cytb基因RPA扩增参考序列，用于引物设计验证。
标准特点
- 技术先进性：结合RPA（快速扩增）和CRISPR（高特异性），提升检测灵敏度。
- 标准化：明确试剂、仪器、步骤及质控要求，确保结果可靠性。
- 应用场景：适用于进出口检验、食品安全监管等领域，快速筛查肉类掺假。
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