T∕CAV 020-2025 人呼吸道合胞病毒中和抗体检测技术指南 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
尊敬的用户你们好，你们的支持是我们前进的动力，网站收集的文件并免费分享都是不容易，如果你觉得本站不错的话，可以收藏并分享给你周围的朋友。
如果你觉得网站不错，找不到本网站，可以百度、360搜搜，搜狗, 神马搜索关键词“文档天下”，就可以找到本网站。也可以保存到浏览器书签里。
收费文件即表明收集不易，也是你们支持，信任本网站的理由！真心非常感谢大家一直以来的理解和支持！
资源简介
以下是对《人呼吸道合胞病毒中和抗体检测技术指南》核心内容的详细总结：
一、文件基础信息
- 标准号：无明确编号
- 发布与实施：2025年4月23日发布并实施
- 归口单位：中国疫苗行业协会
- 起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等8家机构
- 适用范围：人呼吸道合胞病毒（HRSV）中和抗体的定性检测和定量测定，基于噬斑减少中和实验（PRNT）。
二、技术原理与优势
- 方法：基于酶联免疫染色的噬斑减少中和实验（PRNT）
- 核心机制：
- 病毒与血清中和抗体反应后接种细胞，通过辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗与显色底物（TrueBlue）结合形成可视化沉淀，量化噬斑减少程度。
- 优势：
- 高精密度、特异性、重复性；
- 适用于所有HRSV毒株及不同来源血清；
- 无需复杂设备，可视化结果直观。
三、关键试剂与器材
试剂材料
- 细胞：HEp-2细胞（ATCC来源，代次≤30代，定期验证敏感性）
- 核心试剂：
- 一抗：单克隆抗体Palivizumab（0.75 μg/mL）；
- 二抗：HRP标记山羊抗人IgG；
- 显色液：TrueBlue；
- 病毒毒株：标准株或流行株（如Long株）。
- 溶液体系：
- PBST（含0.05%吐温20）、维持液（2% FBS）、培养液（10% FBS）、微晶纤维素覆盖物（附录A详述配制方法）。
器材设备
- 96孔细胞培养板、CO₂培养箱、II级生物安全柜、酶联免疫斑点分析仪、全自动洗板机等。
四、实验操作流程
1. 病毒准备
- 病毒培养：HRSV接种HEp-2细胞，37℃培养至90%细胞病变（合胞体形成），离心收获病毒上清，-80℃保存。
- 病毒滴度测定（PFU/mL）：
- 10倍梯度稀释病毒（10⁻¹~10⁻¹⁰），接种96孔板；
- 覆盖微晶纤维素，培养40~48h；
- 固定后依次加一抗、二抗、TrueBlue显色；
- 酶联斑点分析仪计数，按公式
T = (P × D) / V计算滴度（P：平均噬斑数；D：稀释倍数；V：接种体积）。
2. 中和抗体检测
- 血清处理：56℃水浴灭活30分钟。
- 血清稀释：4倍倍比稀释（起始稀释度1:4，附录B示例）。
- 中和反应：
- 稀释血清与病毒悬液（1×10³ PFU/mL）等体积混合，37℃中和2h。
- 接种与培养：
- 弃细胞板培养基，加入中和混合液（100μL/孔），吸附1h；
- 更换覆盖物，培养40~48h。
- 噬斑检测：
- 固定→PBST洗涤→加一抗（1h）→加二抗（30min）→TrueBlue显色（10min）→酶联斑点分析仪计数。
五、结果判定与质量控制
1. 实验有效性标准
- 病毒对照孔：噬斑数20~200 PFU；
- 细胞对照孔：无噬斑。
2. 中和抗体滴度计算
- 判定标准：抑制50%噬斑形成的最高血清稀释度（PRNT₅₀）；
- 计算公式（Karber法）：
\log NT_{50} = L + d(S - 0.5)L：最低稀释度对数值；d：稀释倍数对数差值；S：各稀释度噬斑减少比率之和（病毒对照为基准）。
六、生物安全要求
- 实验室等级：生物安全二级（BSL-2）实验室（依据《人间传染的病原微生物目录（2023版）》）。
- 规范依据：
- 废弃物处理：遵循GB 19489；
- 实验室管理：符合GB 19489和WS 233。
- 个人防护：实验人员需穿戴防护装备，操作在生物安全柜内进行。
七、附录核心内容
- 附录A（试剂配制）：
- PBST、青-链霉素（10kU/mL青霉素+10mg/mL链霉素）、维持液（2% FBS）、覆盖物（微晶纤维素+2×DMEM）等配方。
- 附录B（操作示例）：
- 血清4倍梯度稀释示意图（图B.1）；
- 96孔板布局：纵向为血清稀释度（双孔/稀释度），横向设细胞对照与病毒对照（图B.2）。
八、参考文献
涵盖法规与标准：
- 《中华人民共和国疫苗管理法》（2019）
- 《中华人民共和国药典》三部（2020）
- GB/T 6682-2008（实验用水标准）
- GB 19489（实验室生物安全通用要求）
- WS 233（病原微生物实验室生物安全通用准则）
总结要点
- 技术核心：PRNT法结合酶联免疫染色，以可视化噬斑减少量化中和抗体。
- 关键创新：解决传统微量中和法对低病变毒株不敏感的问题。
- 标准化流程：从病毒培养、血清处理到结果计算全程标准化，确保可重复性。
- 安全合规：严格遵循生物安全二级标准，强调风险评估与防护。
- 应用价值：为HRSV疫苗和单抗药物的免疫效果评价提供权威检测方案。
评论