NY/T 2467-2025 高粱品种鉴定SSR分子标记法

NY/T２４６７—２０２５
前　　言
本文件按照GB/T１?１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起
草.
本文件代替NY/T２４６７—２０１３«高粱品种鉴定技术规程SSR分子标记法»,与NY/T２４６７—２０１３相
比,除结构调整和编辑性修改外,主要技术变化如下:
a)增加了“NY/T２５９４植物品种鉴定DNA 指纹方法总则”(见２)、“缩略语”(见４)、“参照品种及使
用”(见９)、“参照品种相关信息”(见附录E);
b)删除了“品种”、“核心引物”、“参照品种”(见３)
c)修改了“反应体系”(见１０?３?１)、“反应程序”(见１０?３?２)、“引物及序列”(见附录C)、“引物相关信
息”(见附录D)
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本文件由农业农村部种业管理司提出.
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口.
本文件起草单位:吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心).
本文件主要起草人:李晓辉,张春宵,吴律,辛贵民,李淑芳,王吉艳,周紫阳,郝彩环,刘学岩,董菁,李
继洪,王鼐,陈冰嬬.
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
———２０１３年首次发布为NY/T２４６７—２０１３;
———本次为第一次修订.
Ⅱ
NY/T２４６７—２０２５
高粱品种鉴定　SSR 分子标记法
１　范围
本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行高粱(Sorghumbicolor L?)品种鉴定的术语和定义、
缩略语、原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、数据记录、结
果判定与表述.
本文件适用于高粱品种DNA 分子数据采集和品种鉴定.
２　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅
该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
GB４４０４?１粮食作物种子禾谷类
GB/T３５４３?２农作物种子检验规程扦样
GB/T６６８２分析实验室用水规格和试验方法
GB/T１９５５７?１５植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南　高粱
NY/T２５９４植物品种鉴定DNA 分子标记法总则
３　术语和定义
NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件.
４　缩略语
下列缩略语适用于本文件.
APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate).
bp:碱基对(basepair).
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide).
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid).
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate).
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid).
PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis).
PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction).
SBI:高粱染色体符号(Sorghumbicolor (L?)chromosomesideogram).
SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat).
Taq 酶:耐热DNA 聚合酶(TaqＧDNApolymerase).
TE:三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA).
TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA).
TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine).
Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM).
５　原理
高粱品种基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR 标记,不同高粱品种在同一SSR 的重复次数存在
差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,进而区分不同的高粱品种.
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６　主要仪器设备及试剂
主要仪器设备及试剂见附录A.
７　溶液配制
溶液配制方法见附录B.
８　引物信息及使用
引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测时选择普
通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端,推荐的荧光标记见
附录D.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时,停
止检测.
９　参照品种及使用
参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息
见附录D和附录E.
１０　操作程序
１０?１
样品准备
送检样品材料可为种子、幼嫩叶片等组织或器官.送检样品为种子时,应符合GB４４０１?１中对高粱
种子纯度的规定.
种子样品需扦样时,应符合GB/T３５４３?２的规定.每份样品不少于２０个个体,等量混合分析,必要
时进行个体检测.
１０?２
DNA 提取
称取样品约２００mg,置于２?０mL圆底离心管中,经液氮冷冻后充分研磨.每管加入７００μL预热到
６５℃的CTAB缓冲液,并使其混匀.６５℃水浴加热４５min,每隔１５min轻缓颠倒混匀.水浴后,取出离
心管,冷却至室温.每管加入７００μL的三氯甲烷和异戊醇的混合液(体积比为２４∶１),轻缓混匀５min~
１０min.１２０００rpm 离心１０min,将上清液转至新２?０mL 离心管中.每管加入１０μLRNA 酶溶液
(１０mg/mL),３７℃下水浴３０min.加入７００μL的三氯甲烷和异戊醇的混合液(体积比为２４∶１),轻缓
混匀５min~１０min.１２０００rpm 离心１０min,将上清液转至新２?０mL离心管中.加入－２０℃预冷的
异丙醇(１倍体积)或无水乙醇(２倍体积),轻轻混匀.－２０℃静置至DNA 凝集,室温下钩出DNA.用体
积分数为７０％乙醇溶液洗涤两次,晾干.加入２００ml的１× TE缓冲液充分溶解,检测DNA 浓度和质
量,－２０℃下保存备用.
注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本标准.DNA
溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１?７~２?０之间.
１０?３
PCR 扩增
１０?３?１　引物选择反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表１配制,可以依据试验条件调整.
表１　PCR 扩增反应体系
反应组分原浓度终浓度推荐体积(μL)
１０×缓冲液(含Mg２＋ ) １０× １× ２?０
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表１　(续)
反应组分原浓度终浓度推荐体积(μL)
dNTPs １０mmol/L ０?１５mmol/L ０?３
Taq 酶５U/μL ０?０５U/μL ０?２
正向引物１０μmol/L ０?２５mmol/L ０?５
反向引物１０μmol/L ０?２５mmol/L ０?５
DNA ２０ng/μL ２?０ng/μL ２?０
双蒸水/ / １４?５
总体积２０?０
１０?３?２　反应程序
推荐反应程序:９５℃预变性５min,１个循环;９５℃变性４０s,６０℃退火３５s,７２℃延伸４５s,共３５个
循环;７２℃延伸６０min,４℃保存.
反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当的调整.
１０?４
PCR 产物电泳
１０?４?１　垂直板变性PAGE
１０?４?１?１　制胶
用洗涤剂将玻璃板清洗干净,再用双蒸水、无水乙醇依次擦洗２遍.玻璃板干燥后,将２mL~３mL
亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上,将２mL~３mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上.
操作过程中应防止两块玻璃板互相污染.玻璃板彻底干燥后,将０?４mm 厚的塑料隔条整齐放在长玻璃
板两侧,盖上凹槽短玻璃板,用夹子固定,用水平仪调平.
取５０mL质量分数为６％的PAGE胶溶液,加入６５μL四甲基乙二胺(TEMED)和２５０μL质量分数
为１０％的过硫酸铵(APS),迅速混匀,将胶灌入玻璃胶室,灌胶过程中应防止出现气泡.待胶室灌满后,
在凹槽处将０?４mm 厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约４mm,室温聚合１h以上,胶聚合后,清理
胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用水洗净备用.
１０?４?１?２　变性
２０μLPCR扩增样品加入３μL６× 加样缓冲液,混匀.PCR扩增仪上运行９５℃变性１０min,４℃冷
却１０min以上备用.
１０?４?１?３　电泳
将胶板安装于电泳槽上,在正极槽(下槽)中加入１× TBE缓冲液６００mL,在负极槽(上槽)中加入
０?５× TBE缓冲液６００mL,使其没过电极线.拔出梳子,８０W 恒功率预电泳３０min~４０min.用移液器
吹吸加样槽,清除气泡和杂质.将样品梳(鲨鱼齿朝下)插入凝胶１mm~２mm.每一个加样孔点入４μL
样品.除送检样品外,还宜同时加入参照品种扩增产物和合适的DNA 分子量标准.７０ W 恒功率电泳至
上部的指示带(二甲苯青)达到胶板的中部(４５min~５０min).电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻
撬开,凝胶附着在长玻璃板上.
１０?４?１?４　染色
将附着凝胶的长玻璃板胶面向上浸入固定液中,轻轻晃动３min后取出,在双蒸水中漂洗３min;将胶
板放入新配染色液中,轻轻晃动２０min后取出,在双蒸水中快速漂洗,时间不超过１０s;将胶板放入显影
液中,轻摇晃动待条带清晰后取出,再迅速放入固定液中定影２min取出,在双蒸水中漂洗２min;取出胶
板,晾干,放在胶片观察灯上观察,记录结果,拍照保存.
注:固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量,以淹没胶面为准.
１０?４?２　荧光毛细管电泳
１０?４?２?１　PCR产物样品准备
根据预先确定的引物分组(见附录F),分别取等体积不同荧光标记的扩增产物,混匀稀释.吸取１μL
混合液加入DNA 分析仪配套上样板中.
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注:稀释倍数通过荧光毛细管电泳预实验确定.
１０?４?２?２　变性
上样板中各孔分别加入０?１μL分子量内标和８?９μL去离子甲酰胺.将样品在PCR仪上９５℃变性
５min,取出并立即置于碎冰上,冷却１０min以上.离心１０s后备用.
１０?４?２?３　荧光检测
按照DNA 分析仪器操作手册电泳,并保存电泳原始数据文件.
１０?５
数据分析
１０?５?１　等位变异确定与记录
每个SSR位点的等位变异参照扩增片段大小确定,见附录D.对于变性PAGE,将送检样品在某一
位点扩增片段的迁移位置与对应的参照品种进行比较,确定送检样品在该位点的等位变异.对于荧光毛
细管电泳,通过参照品种消除不同批次或者不同型号DNA 分析仪可能存在的系统误差,使用片段分析软
件读取送检样品在该位点的等位变异.
纯合位点的等位变异数据记录为X/X,杂合位点的等位变异数据记录为X/Y,其中X、Y 分别为该位
点上的两个等位变异,小片段数据在前,大片段数据在后.缺失位点的等位变异数据记录为０/０.
示例１:样品在某个位点上仅出现一个等位变异,为２３１bp,则该位点的等位变异数据记录为２３１/２３１.
示例２:样品在某个位点上有两个等位变异,分别为１６３bp、１７０bp,则该位点的等位变异数据记录为１６３/１７０.
１０?５?２　数据对比与差异位点统计
示例３:逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据,按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判定情形,
记录每个位点的比对结果,统计检测位点数和差异位点数.
１１　结果判定与表述
１１?１
判定规则
依据附录D表D?１中４０对引物的检测结果进行判定.
a)当样品间差异位点数大于２,则判定为“不同品种”;
b)当样品间差异位点数小于等于２,判定为“疑同品种”.
对利用附录C中４０对引物仍未检测到大于２个差异位点数的样品,可按照GB/T１９５５７?１５的规定
进行田间种植鉴定.
１１?２
结果表述
送检样品与对照样品(或对照样品指纹)采用检测,检
测位点数为,差异位点数为,判定为.
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附　录　A
(规范性)
主要仪器设备及试剂

A?１　主要仪器设备
A?１?１　PCR扩增仪.
A?１?２　高压电泳仪:规格为１０V~３０００V、４mA~４００mA、４W~４００W,具有恒电压、恒电流和恒功率
功能.
A?１?３　垂直电泳槽及配套的制胶附件.
A?１?４　普通电泳仪.
A?１?５　水平电泳槽及配套的制胶附件.
A?１?６　高速冷冻离心机:最大离心力不小于１５０００rpm.
A?１?７　水平摇床.
A?１?８　胶片观察灯.
A?１?９　电子天平:感应为０?０１g、０?００１g.
A?１?１０　微量移液器:规格分别为１０mL、２０mL、１００mL、２００mL、１０００mL,连续可调.
A?１?１１　磁力搅拌器.
A?１?１２　核酸浓度测定仪或超微量紫外分光光度计.
A?１?１３　微波炉.
A?１?１４　高压灭菌锅.
A?１?１５　酸度计.
A?１?１６　水浴锅或金属浴.
A?１?１７　低温冰箱.
A?１?１８　制冰机.
A?１?１９　凝胶成像系统或紫外透射仪.
A?１?２０　DNA 分析仪:基于毛细管电泳,有片段分析功能和数据分析软件,能够分辨１个核苷酸大小的
差异.
A?２　主要试剂
除非另有说明,均使用分析纯试剂.
A?２?１　十六烷基三乙基溴化铵[CTAB,C１６H３３(CH３)３NBr,CAS号:５７Ｇ０９Ｇ０].
A?２?２　三氯甲烷(CHCl３,CAS号:６７Ｇ６６Ｇ３).
A?２?３　异丙醇[(CH３)２CHOH,CAS号:６７Ｇ６３Ｇ０].
A?２?４　异戊醇(C５H１２O,CAS号:１２３Ｇ５１Ｇ３).
A?２?５　乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa,C１０H１４N２Na２O８,CAS号:１３９Ｇ３３Ｇ３);
A?２?６　三羟甲基氨基甲烷(Tris,C４H１１NO３,CAS号:７７Ｇ８６Ｇ１).
A?２?７　盐酸(HCl,CAS号:７６４７Ｇ０１Ｇ０).
A?２?８　氢氧化钠(NaOH,CAS号:１３１０Ｇ７３Ｇ２).
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A?２?９　氯化钠(NaCl,CAS号:７６４７Ｇ１４Ｇ５).
A?２?１０　１０×PCR缓冲液.含Mg２＋ ２５mmol/L.
A?２?１１　四种脱氧核苷三磷酸.dATP、dTTP、dGTP、dCTP(浓度均为１０mmol/L).
A?２?１２　SSR引物.
A?２?１３　Taq DNA 聚合酶(Taq 酶,CAS号:９０１２Ｇ９０Ｇ２).５U/mL.
A?２?１４　矿物油(mineraloil,CAS号:８０２０Ｇ８３Ｇ５).
A?２?１５　琼脂糖(Agarose,CAS号:９０１２Ｇ３６Ｇ６).
A?２?１６　DNA 分子量标准.
A?２?１７　核酸染色剂.
A?２?１８　去离子甲酰胺(CH３NO,CAS号:７５Ｇ１２Ｇ７).
A?２?１９　溴酚蓝(C１９H１０Br４O５S,CAS号:１１５Ｇ３９Ｇ９).
A?２?２０　二甲苯青(C２５H２７N２NaO６S２,CAS号:２６５０Ｇ１７Ｇ１).
A?２?２１　甲叉双丙烯酰胺[(H２C＝CHCONH)２CH２,CAS号:１１０Ｇ２６Ｇ９].
A?２?２２　丙烯酰胺(C３H５NO,CAS号:７９Ｇ０６Ｇ１).
A?２?２３　硼酸(H３BO３,CAS号:１００４３Ｇ３５Ｇ３).
A?２?２４　尿素(CH４N２O,CAS号:５７Ｇ１３Ｇ６).
A?２?２５　亲和硅烷(BindingSilane).
A?２?２６　二甲基二氯硅烷(C２H６Cl２Si,CAS号:７５Ｇ７８Ｇ５).
A?２?２７　无水乙醇(C２H６O,CAS号:６４Ｇ１７Ｇ５).
A?２?２８　四甲基乙二胺(TEMED,C６H１６N２,CAS号:１１０Ｇ１８Ｇ９).
A?２?２９　过硫酸铵[APS,(NH４)２S２O８,CAS号:７７２７Ｇ５４Ｇ０].
A?２?３０　冰醋酸(CH３COOH,CAS号:６４Ｇ１９Ｇ).
A?２?３１　硝酸银(AgNO３,CAS号:７７６１Ｇ８８Ｇ８).
A?２?３２　甲醛溶液(HCHO,CAS号:５０Ｇ００Ｇ０).
A?２?３３　DNA 分析仪专用丙烯酰胺胶液.
A?２?３４　DNA 分析仪专用分子量内标Liz标记.
A?２?３５　DNA 分析仪专用光谱校准基质,荧光标记的DNA 片段.
A?２?３６　DNA 分析仪专用电泳缓冲液.
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附　录　B
(规范性)
溶液配制

试剂配制用水应符合标准GB/T６６８２的要求.
B?１　DNA 提取试剂的配制
B?１?１　０?５mol/LEDTA 溶液
称取１８６?１gEDTAＧNa２?２H２O 溶于８００mL水中,加NaOH 调pH 值至８?０,定容至１０００mL,在
１０３?４kPa灭菌(１２１℃)条件下灭菌２０min.
B?１?２　１mol/LTrisＧHCl溶液
称取６０?５５gTrisＧbase溶于８００mL水中,加HCl调pH 至８?０,加水定容至５００mL,在１０３?４kPa
灭菌(１２１℃)条件下灭菌２０min.
B?１?３　０?５mol/LHCl溶液
量取２５mL浓盐酸(质量分数为３６％~３８％),加水定容至５００mL.
B?１?４　CTAB缓冲液
称取２０?０gCTAB、８１?７gNaCl置于１０００mL烧杯中,量取１００mL１mol/LTrisＧHCl溶液和４０mL
０?５mol/LEDTA 溶液倒入烧杯中,加７００mL水,充分搅拌溶解,定容至１０００mL,在１０３?４kPa灭菌
(１２１℃)条件下灭菌２０min.
B?１?５　TE缓冲液
称取１mol/LTrisＧHCl溶液５mL,０?５mol/LEDTA 溶液１mL,加HCl调pH 至８?０,定容至５００mL.
B?２　PCR 扩增试剂的配制
B?２?１　dNTPs溶液
分别配制dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸终浓度１００mmol/L的储存液.各取２０
μL混合,加水１２０μL 定容至每种核苷三磷酸终浓度为１０ mmol/L 的工作液.在１０３?４kPa灭菌
(１２１℃)条件下灭菌２０min,－２０℃保存.
注:也可使用满足试验要求的商品dNTP溶液
B?２?２　SSR 引物
开盖前瞬时离心１０s,按照说明书加TE缓冲液,分别配制正向引物和反向引物终浓度为１００μmol/L
的储存液.分别取１０μL正向引物和反向引物储存液,加８０μLTE缓冲液配制成终浓度１０μmol/L的
工作液.
B?３　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制
B?３?１　质量分数为４０％的丙烯酰胺溶液
称取１９０g丙烯酰胺和１０g甲叉双丙烯酰胺,加水定容至５００mL,混匀.４℃贮存备用.
B?３?２　质量分数为６％ 的变性PAGE胶溶液
称取尿素４５０g置于１０００mL烧杯中,加入１０× TBE缓冲液１００mL、质量分数为４０％的丙烯酰胺
溶液１５０mL,定容至１０００mL.
B?３?３　亲和硅烷工作液
量取２５０μL冰醋酸、２５０μL亲和硅烷,加无水乙醇至５０mL,混匀.分装于１?５mL 离心管中.４℃
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贮存备用.
B?３?４　剥离硅烷工作液
量取１０mL二甲基二氯硅烷和９０mL三氯甲烷,混匀.
B?３?５　质量分数为２５％的过硫酸铵(APS)溶液
称取０?２５g过硫酸铵溶于１mL水中.
B?３?６　１０× TBE缓冲液
称取TrisＧbase１０８g、硼酸５５g、EDTAＧNa２?２H２O７?４４g,定容至１０００mL.
B?３?７　１× TBE缓冲液
量取１０×TBE缓冲液５００mL,加水定容至５０００mL.
B?３?８　０?５× TBE缓冲液
量取１０×TBE缓冲液２５０mL,加水定容至５０００mL.
B?３?９　６×加样缓冲液
称取溴酚兰０?１２５g,二甲苯青０?１２５g,加入去离子甲酰胺４９mL,０?５mmol/LEDTA 溶液１mL
B?４　银染试剂的配制
B?４?１　固定液
量取２００mL冰醋酸,加水定容至２０００mL.
B?４?２　染色液
称取３g硝酸银,加水定容至２０００mL.
B?４?３　显影液
称取２５g氢氧化钠、量取７mL甲醛,溶于２０００mL水中.
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附　录　C
(规范性)
引物及序列

引物及序列见表C?１.
表C?１　引物及序列
引物编号引物名称染色体位置正向序列(５′→３′) 反向序列(５′→３′)
LC１Ｇ０１ SBKAFGK１ SBI０５ AGCATCTTACAACAACCAAT CTAGTGCACTGAGTGATGAC
LC１Ｇ０２ Txp１６８ SBI０７ AGTCAAAACCGCCACAT GAGAAGGGGAGAGGAGAA
LC１Ｇ０３ Txp４２６ SBI０３ GCGTATGAATCTTCGTTTTATTCA CCATCATTTTGATGAAATGCAC
LC１Ｇ０４ SB８６８ SBI０１ CTCATCAGGCTAAAATGATCACCG ATCGAGCACCTGAAACATGAAACA
LC１Ｇ０５ Txp０１５ SBI０５ CACAAACACTAGTGCCTTATC CATAGACACCTAGGCCATC
LC１Ｇ０６ SB５９６ SBI０１ GTACCAGGAGAGGCTGCTCAACAT GGCTTGGCTCTTGCACTAGATGAT
LC１Ｇ０７ SB２５０７ SBI０４ CTTTCTCTCTCCACCTTTTCACGC GGTGTGGATTCTCTGAGGTTTGCT
LC１Ｇ０８ Txp０２１ SBI０４ GAGCTGCCATAGATTTGGTCG ACCTCGTCCCACCTTTGTTG
LC１Ｇ０９ SB５０１４ SBI０９ ATTCCACCGCACAGAATTTGTCTT AAGAACCGTTCATCTCTGCTGACC
LC１Ｇ１０ Txp４１ SBI０４ TCTGGCCATGACTTATCAC AAATGGCGTAGACTCCCTTG
LC２Ｇ０１ SB５４０７ SBI１０ GAGTCTGCGCTTATTGTGCCTTTT TGCCTTTTTGCCAGATCTTTCTTC
LC２Ｇ０２ Txp２３ SBI０５ AATCAACAAGAGCGGGAAAG TTGAGATTCGCTCCACTCC
LC２Ｇ０３ SB３８１１ SBI０６ TGCTATGACTGTCTTTGGCTCACA CTGACTTCGAGCAAGTACAGCAGC
LC２Ｇ０４ Txp０１０ SBI０９ ATACTATCAAGAGGGGAGC AGTACTAGCCACACGTCAC
LC２Ｇ０５ Txp４８１ SBI０７ CCAGGAGATGCCAGAAGTGT GCATAAAACATTTGGAAACTCAAA
LC２Ｇ０６ Txp２８９ SBI０９ AAGTGGGGTGAAGAGATA CTGCCTTTCCGACTC
LC２Ｇ０７ Txp３１７ SBI０６ CCTCCTTTTCCTCCTCCTCCC TCAGAATCCTAGCCACCGTTG
LC２Ｇ０８ Txp７ SBI０２ ACATCTACTACCCTCTCACC ACACATCGAGACCAGTTG
LC２Ｇ０９ SB９３４ SBI０２ CAACCCAAGAGAGGGATTGTGACT CCTCGCTCTTCCAACCTCTTGAAT
LC２Ｇ１０ Txp４２４ SBI０３ GCATCTGTAAGTTGCCACCA ACAGCTGCACTCCAGGATTT
LC３Ｇ０１ Txp６５ SBI０５ CACGTCGTCACCAACCAA GTTAAACGAAAGGGAAATGGC
LC３Ｇ０２ Txp２３０ SBI０９ GCTACCGCTGCTGCTCT AGGGGGCATCCAAGAAAT
LC３Ｇ０３ Txp１２３ SBI０５ TCGGCGAGCATCTTACA TACGTAGGCGGTTGGATT
LC３Ｇ０４ Txp１５９ SBI０７ ACCCAAAGCCCAAATCAG GGGGGAGAAACGGTGAG
LC３Ｇ０５ SB３６８３ SBI０６ GCGAAAAGGATTTTCAACTATGGG TTTGTCTTGCAGTTTCCTGACGAG
LC３Ｇ０６ Gpsb０８９ SBI０１ ATCAGGTACAGCAGGTAGG ATGCATCATGGCTGGT
LC３Ｇ０７ Txp４８２ SBI０１ ATGTGTCCAGCCATGCATAA CTCATGTAGGGGCGAGTGTC
LC３Ｇ０８ Sb１Ｇ１０ SBI０４ ACAGGGCTTTAGGGAAATCG CCATCACCGTCGGCATCT
LC３Ｇ０９ Txp４３６ SBI０３ GGGTGACTGGTCCGTTCTC TTCCAGTCCTTGGTGACCTC
LC３Ｇ１０ Cup０７ SBI１０ CTAGAGGATTGCTGGAAGCG CTGCTCTGCTTGTCGTTGAG
LC４Ｇ０１ Txp４３０ SBI０２ AGTATTTGCCGCTGGTGAAG TCTCGATTTCGACAGGCTTT
LC４Ｇ０２ Txp１３０ SBI１０ TGGGAAGCAGCTCAGG AGGGTGGTGATGTAGGGA
LC４Ｇ０３ Txp８０ SBI０２ GCTGCACTGTCCTCCCACAA CAGCAGGCGATATGGATGAGC
LC４Ｇ０４ Txp５１６ SBI０８ TCCGAGACAACAGGGAGAAG TCCCGCTACTGCATTTCTTT
LC４Ｇ０５ SB５３６０ SBI１０ ATCGAGGTTCCTGCATATCTCAGC CTTTCGACGTACCTGTCCTCGTCT
LC４Ｇ０６ Txp１７ SBI０６ CGGACCAACGACGATTATC ACTCGTCTCACTGCAATACTG
LC４Ｇ０７ Txp４９４ SBI０３ CGTCCTCGTCTCCTTCGTC GCATGTTCAGGAGAGCATCA
LC４Ｇ０８ SB４２７３ SBI０８ GCCGGCATACCAAGAACAAAGTTA TTAAGCTGTCTCACTGCCGAGTTG
LC４Ｇ０９ Txp３２１ SBI０８ TAACCCAAGCCTGAGCATAAGA CCCATTCACACATGAGACGAG
LC４Ｇ１０ Txp９９ SBI０７ CACAAAGGCACCGAACAAAAC CAGAGGCCGAGGACGAG
９
NY/T２４６７—２０２５
附　录　D
(资料性)
引物相关信息

引物相关信息见表D?１.
表D?１　引物相关信息
引物编号引物名称推荐荧光类型PIC 等位变异范围等位变异大小参照品种
LC１Ｇ０１ SBKAFGK１ FAM ０?７０６ １１８~１３７
１１８ F４B
１２２ 康６０
１３１ ５Ｇ２７
１３７ QL３３B
LC１Ｇ０２ Txp１６８ FAM ０?７５６ １７６~１８０
１７６ F４B
１７８ ４２１B
１８０ 晋梁５号
LC１Ｇ０３ Txp４２６ FAM ０?４９９ ２４０~２５２
２４０ 晋梁５号
２４５ TX４３０
２４７ 白平
２５０ TX６２２B
２５２ F４B
LC１Ｇ０４ SB８６８ VIC ０?６５１ １２４~１５２
１２４ 晋梁５号
１３５ ０Ｇ３０
１３８ 吉恢７３８４
１４３ QL３３B
１４６ V４B
１４８ 吉R１０５
１５０ ４２１B
１５２ F４B
LC１Ｇ０５ Txp０１５ VIC ０?６３４ ２００~２２８
２００ ５Ｇ２７
２１２ 晋梁５号
２１６ F４B
２２２ 白平
２２８ 黔高８号
LC１Ｇ０６ SB５９６ NED ０?７１１ １７３~１８４
１７３ 晋梁５号
１７９ QL３３B
１８４ TX６２２B
LC１Ｇ０７ SB２５０７ NED ０?７５６ ２２４~２８３
２４４ 铁恢１５７
２５２ 白平
２５５ ７０５０B
２５９ 晋梁５号
２６６ TX６２２B
２８３ F４B
LC１Ｇ０８ Txp０２１ PET ０?６３８ １７２~１９１
１７２ 晋梁５号
１７４ 克皮西瓦西
１７６ 齐２２
１７８ 吉恢７３８４
１８２ F４B
１８７ 和矬
１９１ ５Ｇ２７
１０
NY/T２４６７—２０２５
表D?１　(续)
引物编号引物名称推荐荧光类型PIC 等位变异范围等位变异大小参照品种
LC１Ｇ０９ SB５０１４ PET ０?６７０ ２２７~２４３
２２７ ７５０１B
２３１ 晋梁５号
２３７ QL３３B
２４３ V４B
LC１Ｇ１０ Txp４１ PET ０?７６３ ２６５~３００
２６５ 永５９
２６８ 辽恢１１５
２７５ 吉恢７３８４
２８０ F４B
２８４ 晋梁５号
２９８ QL３３B
３００ ４２１B
LC２Ｇ０１ SB５４０７ FAM ０?７１９ １２３~１５２
１２３ 晋梁５号
１３３ QL３３B
１３９ V４B
１４１ TX６２２B
１４８ 铁恢１５７
１５２ 铁恢６号
LC２Ｇ０２ Txp２３ FAM ０?７２０ １７６~２００
１７６ QL３３B
１７８ 铁恢６号
１８２ ７５０１B
１８４ 晋梁５号
１８６ 三尺三
１９６ 铁恢２０８
LC２Ｇ０３ SB３８１１ FAM ０?７４３ ２４２~２４８
２４２ 铁恢１５７
２４４ 晋梁５号
２４６ TX６２２B
２４８ QL３３B
LC２Ｇ０４ Txp０１０ VIC ０?７９０ １３３~１５０
１３３ 三尺三
１４２ 晋梁５号
１４４ TX６２２B
１４６ F４B
１４８ QL３３B
１５０ ５Ｇ２７
LC２Ｇ０５ Txp４８１ VIC ０?７５９ ２０５~２２５
２０５ 晋梁５号
２０９ ０Ｇ３０
２１１ TX６２２B
２１３ 吉恢７３８４
２１５ QL３３B
２１７ 铁恢２０８
２２０ 铁恢１５７
２２５ F４B
LC２Ｇ０６ Txp２８９ VIC ０?６８９ ２６３~３２０
２６３ LTR１０８
２６９ QL３３B
２７２ 晋梁５号
２７６ 铁恢１５７
２８８ TX６２２B
２９４ 康６０
３００ 克皮西瓦西
３２０ 永５９
１１
NY/T２４６７—２０２５
表D?１　(续)
引物编号引物名称推荐荧光类型PIC 等位变异范围等位变异大小参照品种
LC２Ｇ０７ Txp３１７ NED ０?４９９ ２５９~２６５
１５９ TX６２２B
１６２ F４B
１６５ 克皮西瓦西
LC２Ｇ０８ Txp７ NED ０?５３５ ２１３~２３９
２１３ F４B
２２２ 铁恢１５７
２３１ QL３３B
２３５ 鄂荆四不像
２３９ 齐２２
LC２Ｇ０９ SB９３４ PET ０?６２３ １６８~１８７
１６８ ７５０１B
１８１ QL３３B
１８５ 晋梁５号
１８７ ０Ｇ３０
LC２Ｇ１０ Txp４２４ PET ０?７１３ ２２６~２４０
２２６ F４B
２３４ TX６２２B
２３６ ４２１B
２３８ 矮四
２４０ 晋梁５号
LC３Ｇ０１ Txp６５ FAM ０?５８０ １２１~１３６
１２１ 矮四
１２６ TX６２２B
１２９ 铁恢１５７
１３１ QL３３B
１３３ TX４３０
１３６ 新高粱２号
LC３Ｇ０２ Txp２３０ FAM ０?８２２ １６４~２０１
１６４ 鄂荆四不像
１７０ F４B
１７８ QL３３B
１８２ 永５９
１８７ 白平
１９５ 铁恢２０８
１９７ ０Ｇ３０
２０１ 康６０
LC３Ｇ０３ Txp１２３ FAM ０?５９６ ２５６~２７３
２５６ 晋梁５号
２５９ ７５０１B
２６７ ５Ｇ２７
２７３ TX６２２B
LC３Ｇ０４ Txp１５９ VIC ０?８０７ １５５~１９６
１５５ ３１４B
１６５ 晋梁５号
１７０ 永５９
１７３ F４B
１７９ QL３３B
１８４ 吉恢７３８４
１９６ 黔高８号
LC３Ｇ０５ SB３６８３ VIC ０?７１１ ２３１~２４５
２３１ 晋梁５号
２３６ QL３３B
２４２ F４B
２４５ ５Ｇ２７
LC３Ｇ０６ Gpsb０８９ NED ０?６５１ １６６~１７４
１６６ 晋梁５号
１６８ ４２１B
１７０ F４B
１７４ 白平
１２
NY/T２４６７—２０２５
表D?１　(续)
引物编号引物名称推荐荧光类型PIC 等位变异范围等位变异大小参照品种
LC３Ｇ０７ Txp４８２ NED ０?５７２ ２２５~２３５
２２５ 晋梁５号
２２９ 铁恢１５７
２３１ F４B
２３５ TX６２２B
LC３Ｇ０８ Sb１Ｇ１０ NED ０?６３４ ２８５~３１２
２８５ F４B
２９８ 晋梁５号
３０４ ５Ｇ２７
３１２ 康６０
LC３Ｇ０９ Txp４３６ PET ０?３１４ １３８~１５８
１３８ 铁恢１５７
１４１ 晋梁５号
１４９ TX６２２B
１５５ 吉恢７３８４
１５８ ４２１B
LC３Ｇ１０ Cup０７ PET ０?７０６ １９４~２７３
１９４ 晋梁５号
１９７ LR９１９８
２５８ F４B
２７０ TX６２２B
２７３ V４B
LC４Ｇ０１ Txp４３０ FAM ０?５２９ １５５~１６７
１５５ ７５０１B
１５８ 晋梁５号
１６７ 铁恢１５７
LC４Ｇ０２ Txp１３０ FAM ０?６２６ ２４７~２５７
２４７ 铁恢１５７
２５０ 晋梁５号
２５３ F４B
２５５ QL３３B
２５７ 永５９
LC４Ｇ０３ Txp８０ FAM ０?７０９ ２８２~３１７
２８２ 晋辐１号
２８４ F４B
２９４ 晋梁５号
２９８ 吉恢７３８４
３００ QL３３B
３１７ 永５９
LC４Ｇ０４ Txp５１６ VIC ０?５８０ １６１~１７２
１６１ 晋梁５号
１６３ 吉恢７３８４
１６３/１７０ 鄂荆三不像
１７２ QL３３B
LC４Ｇ０５ SB５３６０ VIC ０?７７２ ２３７~２６６
２３７ F４B
２３９ QL３３B
２４１ 晋梁５号
２５０ 康６０
２５２ 铁恢１５７
２５０/２６６ 吉杂１２４
LC４Ｇ０６ Txp１７ NED ０?７６６ １６２~１８８
１６２ 铁恢１５７
１６４ QL３３B
１６８ 铁恢２０８
１８４ 白平
１８６ 晋梁５号
１８８ 三尺三
１３
NY/T２４６７—２０２５
(续)
引物编号引物名称推荐荧光类型PIC 等位变异范围等位变异大小参照品种
LC４Ｇ０７ Txp４９４ NED ０?７４４ １９７~２２４
１９７ QL３３B
２０６ F４B
２０９ ４２１B
２１２ 铁恢１５７
２１５ TX６２２B
２１８ 吉恢７３８４
２２４ 康６０
LC４Ｇ０８ SB４２７３ NED ０?２６８ ２５７~２６８
２５７ 吉４１９０A
２６０ 三尺三
２６８ 晋梁５号
LC４Ｇ０９ Txp３２１ PET ０?８０６ １９２~２３５
１９２ 永５９
２０２ TX４３０
２０５ F４B
２０９ TX６２２B
２１２ 吉恢７３８４
２２１/２３５ 川糯粱１号
２３５ 晋梁５号
LC４Ｇ１０ Txp９９ PET ０?４００ ２７２~２８９
２７２ ４２１B
２７５ V４B
２７７ 齐２２
２８７ 晋梁５号
２８９ 白平
附录D中采用的荧光标记仅为示例,采用其他类型荧光标记时,应使用参照品种校正数据.
附录D中未包括的等位变异,应按本文件方法,确定其大小和相应参照品种.
附录D中所列参照品种仅为示例,与参照品种具有相同等位变异的其他品种也可用作该等位变异的参照品种.
同一名称不同来源的参照品种,在某些位点上的等位变异可能不相同,使用前应确认其等位变异.
１４
NY/T２４６７—２０２５
附　录　E
(资料性)
参照品种相关信息

参照品种相关信息见表E?１.
表E?１　参照品种相关信息
序号参照品种名称来源
１ ５Ｇ２７ 国家农作物种质资源保存中心
２ ０Ｇ３０ 国家农作物种质资源保存中心
３ ３１４B 国家农作物种质资源保存中心
４ ４２１B 国家农作物种质资源保存中心
５ ７０５０B 国家农作物种质资源保存中心
６ ７５０１B 国家农作物种质资源保存中心
７ F４B 国家农作物种质资源保存中心
８ LR９１９８ 国家农作物种质资源保存中心
９ LTR１０８ 国家农作物种质资源保存中心
１０ QL３３B 国家农作物种质资源保存中心
１１ TX４３０ 国家农作物种质资源保存中心
１２ TX６２２B 国家农作物种质资源保存中心
１３ V４B 国家农作物种质资源保存中心
１４ 矮四国家农作物种质资源保存中心
１５ 白平国家农作物种质资源保存中心
１６ 川糯粱１号国家农作物种质资源保存中心
１７ 鄂荆三不像国家农作物种质资源保存中心
１８ 鄂荆四不像国家农作物种质资源保存中心
１９ 和矬国家农作物种质资源保存中心
２０ 吉４１９０A 国家农作物种质资源保存中心
２１ 吉R１０５ 国家农作物种质资源保存中心
２２ 吉恢７３８４ 国家农作物种质资源保存中心
２３ 吉杂１２４ 国家农作物种质资源保存中心
２４ 晋辐１号国家农作物种质资源保存中心
２５ 晋梁５号国家农作物种质资源保存中心
２６ 康６０ 国家农作物种质资源保存中心
２７ 克皮西瓦西国家农作物种质资源保存中心
２８ 辽恢１１５ 国家农作物种质资源保存中心
２９ 齐２２ 国家农作物种质资源保存中心
３０ 黔高８号国家农作物种质资源保存中心
３１ 三尺三国家农作物种质资源保存中心
３２ 铁恢１５７ 国家农作物种质资源保存中心
３３ 铁恢２０８ 国家农作物种质资源保存中心
３４ 铁恢６号国家农作物种质资源保存中心
３５ 新高粱２号国家农作物种质资源保存中心
３６ 永５９ 国家农作物种质资源保存中心
１５
NY/T２４６７—２０２５
附　录　F
(资料性)
引物分组

引物分组见表F?１.
表F?１　引物分组
组别FAM 标记引物VIC标记引物NED标记引物PET标记引物
１
LC１Ｇ０１(１１８~１３７)
LC１Ｇ０２(１７６~１８０)
LC１Ｇ０３(２４０~２５２)
LC１Ｇ０４(１２４~１５２)
LC１Ｇ０５(２００~２２８)
LC１Ｇ０６(１７３~１８４)
LC１Ｇ０７(２２４~２８３)
LC１Ｇ０８(１７２~１９１)
LC１Ｇ０９(２２７~２４３)
LC１Ｇ１０(２６５~３００)
２
LC２Ｇ０１(１２３~１５２)
LC２Ｇ０２(１７６~２００)
LC２Ｇ０３(２４２~２４８)
LC２Ｇ０４(１３３~１５０)
LC２Ｇ０５(２０５~２２５)
LC２Ｇ０６(２６３~３２０)
LC２Ｇ０７(２５９~２６５)
LC２Ｇ０８(２１３~２３９)
LC２Ｇ０９(１６８~１８７)
LC２Ｇ１０(２２６~２４０)
３
LC３Ｇ０１(１２１~１３６)
LC３Ｇ０２(１６４~２０１)
LC３Ｇ０３(２５６~２７３)
LC３Ｇ０４(１５５~１９６)
LC３Ｇ０５(２３１~２４５)
LC３Ｇ０６(１６６~１７４)
LC３Ｇ０７(２２５~２３５)
LC３Ｇ０８(２８５~３１２)
LC３Ｇ０９(１３８~１５８)
LC３Ｇ１０(１９４~２７３)
４
LC４Ｇ０１(１５５~１６７)
LC４Ｇ０２(２４７~２５７)
LC４Ｇ０３(２８２~３１７)
LC４Ｇ０４(１６１~１７２)
LC４Ｇ０５(２３７~２６６)
LC４Ｇ０６(１６２~１８８)
LC４Ｇ０７(１９７~２２４)
LC４Ｇ０８(２５７~２６８)
LC４Ｇ０９(１９２~２３５)
LC４Ｇ１０(２７２~２８９)
注１:括号内是各引物的等位变异范围.
注２:同组别内引物的扩增产物可以多重电泳.
注３:可结合引物等位变异范围,更换荧光标记,调整分组.