T/CAS 951-2024 基于酶标记二抗的免疫组织化学检测质量控制规范

ICS 11.100
CCS C 05
团体标准
T/CAS 951—2024
基于酶标记二抗的免疫组织化学检测质量控制规范
Quality control specifications for immunohistochemical detection based on enzyme-labeled secondary antibody
2024-09-27 发布2024-09-27 实施
中国标准化协会 发布

目 次
前言 .............................................................................................................................................................. III
1 范围 .......................................................................................................................................................... 1
2 规范性引用文件 ...................................................................................................................................... 1
3 术语和定义 .............................................................................................................................................. 1
4 缩略语 ...................................................................................................................................................... 2
5 实验室基本要求 ...................................................................................................................................... 2
5.1 人员要求 ........................................................................................................................................... 2
5.2 实验室要求 ....................................................................................................................................... 2
5.3 仪器和设备要求 ............................................................................................................................... 3
5.4 试剂要求 ........................................................................................................................................... 3
6 操作程序 .................................................................................................................................................. 3
6.1 组织前处理 ....................................................................................................................................... 3
6.2 新鲜组织样本和细胞样本的前处理 ................................................................................................ 5
6.3 染色前准备 ....................................................................................................................................... 5
6.4 染色的判读 ....................................................................................................................................... 6
7 质量控制 .................................................................................................................................................. 6
7.1 设备质控要求 ................................................................................................................................... 6
7.2 对照物质控要求 ............................................................................................................................... 7
7.3 试剂质控要求 ................................................................................................................................... 7
7.4 过程质控要求 ................................................................................................................................... 7
7.5 室间质评/实验室间比对 ................................................................................................................... 7
参考文献 ........................................................................................................................................................ 8

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III
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件起草单位：中国医学科学院北京协和医院、遵义医科大学附属医院、南京大学医学院附属鼓楼医院、安徽医科大学第一附属医院、佰诺全景生物技术（北京）有限公司、北京大学第一医院、北京实安科技有限公司、北京整合医学学会/北京检验医学学会、北京中杉金桥生物技术有限公司、长治市中医医院、空军军医大学基础医学院病理学教研室暨第一附属医院、徕卡生物科技（上海）有限公司、天津市儿童医院（天津大学儿童医院）、无锡市妇幼保健院、右江民族医学院附属医院、浙江大学医学院附属第一医院、中山大学肿瘤防治中心、中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）、中山市人民医院、国军标（北京）标准化技术研究院、通标伟业（北京）标准化技术研究院。
本文件主要起草人：薛晓伟、王进京、付尧、吴鸿雁、樊祥山、罗文武、焦磊、熊焰、李娜、 穆红、马慧宁、李晓霞、刘忠理、柴益鹏、范林妮、毛杰、赵林胜、印永祥、龙喜带、孙婷、丁伟、卢佳斌、孙世珺、孙琦、戴其全、王燕、许雪英、樊素慧。
本文件为首次发布。

T/CAS 951—2024
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基于酶标记二抗的免疫组织化学检测质量控制规范
1 范围
本文件规定了基于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记二抗的免疫组织化学检测实验室基本要求、操作程序和质量控制的要求。
本文件适用于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记二抗的免疫组织化学技术的检测以及免疫组化实验室的质量控制。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 15066 不锈钢压力锅
GB 19781 医学实验室 安全要求
GB/T 23128 电磁灶
GB/T 29791.2 体外诊断医疗器械 制造商提供的信息（标示） 第2部分：专业用体外诊断试剂
GB 39707 医疗废物处理处置污染控制标准
JB/T 5479 荧光生物显微镜
QB/T 5546 载玻片 盖玻片
CNAS-CL02:2023 医学实验室质量和能力认可准则
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
免疫组织化学 immunohistochemistry；IHC
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记在抗体上的显色物质（荧光素、酶、金属离子、同位素、色原体）显色来检测组织细胞抗原，对其进行定位、定性及半定量检测的技术。
[来源：YY/T 1181—2021，3.1，有修改]
3.2
组织固定 tissue fixation
将组织浸入适宜的固定剂，使细胞内的物质尽可能保持在其生活状态时的形态、结构和位置的
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2
过程。
3.3
抗体 antibody
由免疫原性物质刺激B-淋巴细胞产生，并能与免疫原性物质结合的特异性免疫球蛋白。
注：免疫原性物质的分子包含一种或多种帯有独特化学成分的部分，即表位。
[来源：YY/T 0639—2019，3.1]
3.4
抗原 antigen
在免疫学中，凡能刺激机体免疫系统产生抗体，并能与其相应抗体发生特异性反应的物质。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ALK：间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase）
ALP：碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）
AEC：3-氨基-9-乙基咔唑（3-Amino-9-ethylcarbazole）
DAB：二氨基联苯胺（Diaminobenzidine 3,3）
HRP：辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer）
5 实验室基本要求
5.1 人员要求
人员要求应符合CNAS-CL02:2023中6.2的要求。
5.2 实验室要求 免疫组织化学检测实验室应符合《病理科建设与管理指南（试行）》的要求，实验室空间设置应考虑免疫组织化学染色机、纯水仪、电磁炉、蒸汽压力锅、恒温箱、生物显微镜等设备厂商要求，满足空间、温度、湿度、电源等指标，并按照GB 19781的要求对实验室进行充分的生物安全风险评估，针对生物、化学、放射及物理等危害制定防护性措施及合适的警告。 基本要求包括：
a)
应依据检测设备和检测过程要求，建立免疫组织化学检测实验室设施和环境要求，免疫组织化学实验室的空间和布局应与实验室活动相匹配，宜设立单独的免疫组织化学染色区域；
b)
有害试剂应在通风橱中操作；
c)
每年应对工作区进行有害气体浓度检测，保证有害气体浓度在规定许可的范围；
d)
免疫组织化学染色水质应符合GB/T 6682的要求；
e)
相关医疗废弃物的处理应符合GB 39707的要求。
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5.3 仪器和设备要求
5.3.1 免疫组织化学染色机 免疫组织化学染色机应包括：
a)
全自动液路系统；
b)
机器清洁系统；
c)
控温系统；
d)
条码扫描系统；
e)
组织保护系统；
f)
试剂混合配置系统；
g)
染色系统：预置染色标准程序，具备延时启动功能。 免疫组织化学染色机应具备以下功能：
a)
试剂安全：有毒废液与无毒废液区分排放；
b)
软件要求：软件具备升级功能、数据储存功能、质量控制功能和打印功能，可与现行的病理科网络连接；
c)
报警及安全指标：设备监测指标异常、设备故障时具备报警功能。
5.3.2 电磁炉和蒸汽压力锅 电磁炉应符合GB/T 23128的要求、蒸汽压力锅应符合GB 15066的要求。
5.3.3 生物显微镜 免疫组织化学实验室所用生物显微镜应符合JB/T 5479的要求。
5.4 试剂要求
5.4.1 免疫组织化学抗体及显色剂
免疫组织化学抗体及显色剂的选择的要求包括：
a)
一抗、二抗和显色剂等应按照《体外诊断试剂分类目录》选择相应备案要求的试剂，并符合GB/T 29791.2的要求；
b)
选择二抗时应选择与组织无交叉反应的酶标二抗；
c)
显色剂的选择：HRP标记的二抗均宜选用稳定性好的DAB作为显色剂；当组织内含有黑色素时宜选用ALP显色。
6 操作程序
6.1 组织前处理
6.1.1 组织固定
组织固定要求包括：
a)
常规固定应使用10 %中性缓冲福尔马林（pH 7.2～pH 7.4）为固定液；
b)
固定液应充分覆盖组织标本，体积宜为组织大小的4倍～10倍；
c)
手术标本在离体后应及时剖开固定，在60 min之内完成；
注：对于特殊样本，如胃癌标本，应在30 min内固定；细胞学及穿刺小组织标本应立即固定。
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d)
常规固定应使用10 %中性缓冲福尔马林（pH 7.2～pH 7.4）；
e)
固定液应充分覆盖组织标本，体积宜为组织大小的4倍～10倍；
f)
固定时间根据组织大小，在6 h～48 h之间，直径小于2 mm的活检组织固定时间不应少于6 h，直径大于5 mm的组织固定时间宜在24 h～48 h；
g)
含骨组织应先充分固定后进行脱钙，使用含酸脱钙液脱钙后宜用pH 8.0～pH 10.0的乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）缓冲液进行中和，减少抗原因脱钙液而破坏。
6.1.2 组织脱水
组织脱水的要求包括：
a)
使用梯度乙醇脱水；
b)
脱水过程应缓慢进行，每种梯度乙醇的作用时间宜设定为60 min～120 min；
c)
在设定脱水程序之前，应进行脱水效果的有效性验证；
d)
脱水剂应定期或根据组织数量进行更换，确认达到脱水效果。
6.1.3 组织透明
组织透明的要求包括：
a)
透明程序宜使用二道透明剂，宜根据组织的类型和大小及脱水机的效率，每道时间应设置在15 min～60 min；
b)
透明剂的使用应在通风橱中进行；
c)
透明剂应定期或根据组织数量更换。
6.1.4 组织浸蜡
组织浸蜡的要求包括：
a)
透明后的组织应经过2次～3次浸蜡程序，每次时间为30 min～90 min；
b)
建议使用熔点为56 ℃～58 ℃ 或58 ℃～60 ℃的优质切片石蜡，浸蜡温度控制在60 ℃～62 ℃；
c)
监控石蜡温度和石蜡缸内的容量，及时更换和补充石蜡。
6.1.5 组织包埋
组织包埋的要求包括：
a)
宜使用合适熔点的石蜡，同6.1.4的要求；
b)
在包埋组织时，应根据所处理组织的类型决定组织的包埋方向；
c)
每包埋一个盒子样本，应更换一把镊子，防止组织污染。
6.1.6 切片和烤片
切片和烤片的要求包括：
a)
切片厚度应为2 μm～4 μm；
b)
载玻片的选用应符合QB/T 5546的规定，采用粘附载玻片，捞片应平整无气泡，组织方向应一致；
c)
应根据烤片温度确定烤片时间，例如60 ℃～65 ℃烤片时间应控制在60 min～120 min，70℃～80 ℃烤片时间应控制在30 min～60 min，不应高温长时间烤片。
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6.2 新鲜组织样本和细胞样本的前处理
前处理的要求包括：
a)
新鲜组织样本及时放入冷冻切片机内冷冻并切片；如不能及时处理，可放入-80 ℃冰箱或液氮中保存样本；
b)
新鲜组织样本冷冻切片后应及时固定。固定液应根据实验具体要求选择含有丙酮（10 min～20 min）、甲醛或乙醇的固定液，固定液量应充分，固定时间应适当；
c)
细胞样本应及时离心后涂片。涂片后及时放入含有丙酮、甲醛或乙醇的固定液，固定液量应充分，固定时间应适当；
d)
细胞样本如需要制备成细胞蜡块，则离心沉淀后用滤纸或渗透性好的纸张包裹，放入10 %中性缓冲福尔马林（pH 7.2～pH 7.4）固定液，余下要求同6.1。
6.3 染色前准备
6.3.1 染色手工操作流程 开始实验前，应核对样本检测信息，核对无误后进入实验环节。手工操作流程包括：
a)
脱蜡、水化；
b)
抗原修复（可选择热修复方式或酶修复方式）；
c)
蒸馏水清洗；
d)
3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，室温孵育10 min；
e)
蒸馏水清洗；
f)
用免疫组织化学笔在距离组织2 mm～3 mm处画圈；
g)
PBS清洗3次，2 min/次；
h)
滴加适量一抗和对照试剂，37 ℃ 1 h或4 ℃过夜；
i)
PBS清洗3次，2 min/次；
j)
滴加适量二抗试剂（HRP/ALP标记二抗），37 ℃ 20 min；
k)
PBS清洗3次，2 min/次；
l)
显色剂显色，根据不同酶标抗体检测系统合理搭配显色剂（见表1），HRP标记通常建议选择DAB显色，ALP标记建议选择固红或固蓝显色；
表1 免疫组织化学检测中显色剂与复染剂的选择 二抗标记酶 显色剂 复染剂 HRP DAB 苏木素 HRP AEC 苏木素 HRP
品红（Magenta） 苏木素 ALP 固蓝 核固红 ALP 固红 苏木素 ALP 新复红 苏木素 ALP 对甲苯胺蓝/氯化硝基四氮唑蓝 核固红
m)
复染，应根据颜色对比清晰的原则进行搭配（见表1）；
注：常用的细胞核复染剂有苏木素和核固红两种，不同的复染试剂染色结果颜色不同，其中苏木素呈蓝色，核固红呈红色。
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n)
流动水冲洗；
o)
分化和返蓝（根据复染剂的需求），流动水冲洗3 min～5 min；
p)
梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片（如DAB显色）或水溶性封片剂封片（如AEC显色）。
注1：如采用商品化的试剂或试剂盒可参考说明书。
注2：新鲜样本冷冻切片和细胞样本的实验操作流程从e）开始到p）结束。
6.3.2 免疫组织化学染色机的操作流程
免疫组织化学染色机操作流程包括：
a)
操作前免疫组化染色机检查和启动；
b)
程序和试剂检查；
c)
设置玻片，部分实验室信息系统与免疫组化机连接后，此步骤可直接在切片操作打印玻片时完成；
d)
装载试剂；
e)
运行程序；
f)
仪器的维护和保养。
注：具体操作流程可参照设备说明书进行。
6.4 染色的判读
抗原表达应在特定部位，且定位清晰准确，而无背景染色；组织的前处理不佳导致的抗原异位，此时不应判读为阳性；抗体的不同克隆号在不同组织中的定位不同，此时应标注阳性部位某些抗体在不同肿瘤类型表达的部位不同，此时应标注阳性部位，要求如下：
a)
阴性结果的判读应区分真阴性和假阴性，由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致假阴性反应；
b)
应区分在出血、坏死、刀痕和边缘细胞区域出现的非特异性的阳性信号；
注：结合形态学特征和病理诊断等分析免疫组织化学染色结果。
c)
定性判读：免疫组织化学染色结果判读过程中，多数染色结果的判读为定性。阳性是指在对照染色结果可信的前提下，信号出现在预期部位（分为细胞膜型、细胞质型、细胞核型、复合型四种阳性细胞类型），强度可以被观察到，反之则为阴性；
d)
半定量判读：参考组织化学评分（histochemistry score，H-SCORE），或结合染色强度与阳性细胞数积分进行综合判读；
e)
免疫反应的形态是判读的重要参考依据，如嗜铬粒素（chromogranin A，CgA）等的染色应呈细胞质内的颗粒状，如呈胞质均匀一致的染色效果，则染色结果不可靠；
f)
有些抗原（如错配修复基因等）在正常组织普遍表达，而在特定的肿瘤中缺失表达。
7 质量控制
7.1 设备质控要求
设备质控要求包括：
a)
仪器开机使用应准备好所需试剂，试剂状态及相应的辅助设施应满足正常工作的需求；
b)
对于多台仪器可同时做一种检测项目，每年应对仪器设备间进行内部比对；
c)
新装机的仪器设备，应经过工作水平测试，满足性能要求，方可投入使用；
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d)
仪器设备发生故障，维修后，应对仪器的工作参数及工作结果、性能进行复验，满足要求方可投入再次使用。
7.2 对照物质控要求
对照物质控要求包括：
a)
每日上机染色切片应设置阴性、阳性对照。可利用每张玻片检测组织的内对照作为阴阳对照，对于没有内部参照的检测样本，每张染色检测项目应使用带阳性对照切片，对照可利用每张玻片检测组织的内对照作为阴阳对照组织块宜涵盖阴性组织对照；
b)
对照物的选定，可以是经医生确认过的特定组织类型，也可以根据判读强度决定值的差异；
c)
组织对照应设置在标签位置的远端，不应妨碍检测组织的判读。
7.3 试剂质控要求
试剂质控要求包括：
a)
严格按照试剂配比要求进行试剂的配制。定期对纯水机的电阻率进行期间核查，确认水质的安全；
b)
对于检测过程中有特殊要求的可设置试剂阴性对照，如ALK检测；
c)
对于不同批次间的试剂，如旧批号试剂快用完之前，需进行对新旧批号检测，结果在质控范围内方可进行更换。若新试剂检测结果不符合要求，则应更换试剂；
d)
对于新的检测项目/新准入试剂，确定预期阴、阳性标本实验并进行记录，非工作液应对该抗体进行至少三个梯度的稀释，根据阴、阳性标本的染色结果确定最佳工作条件和最佳染色强度，不出现假阴性及假阳性染色和非特异着色。
7.4 过程质控要求
过程质控要求包括：
a)
免疫组织化学检测实验室应根据国家卫健委病理专业医疗质量控制指标设立免疫组化染色切片优良率以反映免疫组化切片染色及制片质量，免疫组化切片质量考核标准参考CNAS-GL048:2021中A.1.4的要求；
b)
宜在每张切片上使用外部对照作为质控物；
c)
宜定期对质控数据进行分析；
d)
有室内质控失控时的处理流程。
7.5 室间质评/实验室间比对
室间质评/实验室间对比包括：
a)
免疫组织化学检测实验室应根据国家卫健委病理专业医疗质量控制指标（2024年版）设立免疫组化染色室间质评合格率（指参加省级及以上病理质控中心、国际标准化组织或中国合格评定国家认可委等质控机构组织的室间质评）。室间质评不可获得的项目，可参考WS/T 415通过与其他实验室比对的方法确定结果的可接受性；
b)
实验室应室间质评/实验室间比对结果，当结果不合格时，应采取适当措施。
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参考文献 [1] WS/T 415—2013 无室间质量评价时实验室检测评估方法 [2] YY/T 0639—2019 体外诊断医疗器械 制造商为生物学染色用体外诊断试剂提供的信息 [3] YY/T 1181—2021 免疫组织化学试剂盒
[4] CNAS-CL02-A001 医学实验室质量和能力认可准则的应用要求
[5] CNAS-GL048:2021 医学实验室组织病理学检查领域认可指南
[6] 《病理科建设与管理指南（试行）》（卫办医政发〔2009〕31号）
[7] 《病理专业医疗质量控制指标（2024年版）》（国卫办医政函〔2024〕150号）
[8] 《体外诊断试剂分类目录》（国家药监局公告（2024）58号）