T/CAS 952-2024 基于荧光标记二抗的免疫组织化学检测 质量控制规范

ICS 11.100
CCS C 05
团体标准
T/CAS 952—2024
基于荧光标记二抗的免疫组织化学检测 质量控制规范
Quality control specifications for immunohistochemical detection based on fluorescently labeled secondary antibodies
2024-09-27 发布2024-09-27 实施
中国标准化协会 发布

中国标准化协会（CAS）是组织开展国内、国际标准化活动的全国性社会团体。制定中国标准化协会标准（以下简称：中国标协标准），满足市场需要，增加标准的有效供给，是中国标准化协会的工作内容之一。中国境内的团体和个人，均可提出制、修订中国标协标准的建议并参与有关工作。
中国标协标准按《中国标准化协会标准管理办法》进行制定和管理。
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II
目 次
前言 .............................................................................................................................................................. III
1 范围 .......................................................................................................................................................... 1
2 规范性引用文件 ...................................................................................................................................... 1
3 术语和定义 .............................................................................................................................................. 1
4 缩略语 ...................................................................................................................................................... 2
5 实验基本要求 .......................................................................................................................................... 3
5.1 人员要求 ........................................................................................................................................... 3
5.2 实验室要求 ....................................................................................................................................... 3
5.3 仪器和设备 ....................................................................................................................................... 3
5.4 试剂要求 ........................................................................................................................................... 4
6 操作程序 .................................................................................................................................................. 4
6.1 组织前处理 ....................................................................................................................................... 4
6.2 新鲜组织样本和细胞样本的前处理 ................................................................................................ 5
6.3 染色前准备 ....................................................................................................................................... 5
6.4 染色的判读 ....................................................................................................................................... 6
7 质量控制 .................................................................................................................................................. 7
7.1 总则 ................................................................................................................................................... 7
7.2 设备和试剂的质量控制 .................................................................................................................... 7
7.3 组织处理的质量控制 ........................................................................................................................ 7
7.4 切片的质量控制 ............................................................................................................................... 7
7.5 抗原修复的质量控制 ........................................................................................................................ 7
7.6 孵育条件的质量控制 ........................................................................................................................ 8
7.7 对照的质量控制 ............................................................................................................................... 8
7.8 阅片的质量控制 ............................................................................................................................... 8
7.9 室间质评 ........................................................................................................................................... 8
参考文献 ........................................................................................................................................................ 9

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III
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件起草单位：安徽医科大学第一附属医院、遵义医科大学附属医院、中国医学科学院北京协和医院、南京大学医学院附属鼓楼医院、浙江大学医学院附属第一医院、空军军医大学基础医学院病理学教研室暨第一附属医院、中山大学肿瘤防治中心、中山市人民医院、佰诺全景生物技术（北京）有限公司、北京大学第一医院/北京大学泌尿外科研究所病理室、北京实安科技有限公司、北京整合医学学会/北京检验医学学会、北京中检体外诊断工程技术研究中心、北京中杉金桥生物技术有限公司、长治市中医医院、天津市儿童医院（天津大学儿童医院）、中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）、国军标（北京）标准化技术研究院、通标伟业（北京）标准化技术研究院。
本文件主要起草人：付尧、樊祥山、王进京、薛晓伟、丁伟、吴鸿雁、罗文武、孙婷、范林妮、卢佳斌、孙世珺、焦磊、王爱香、李娜、穆红、马慧宁、李晓霞、赵林胜、孙琦、戴其全、王燕。
本文件为首次发布。

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1
基于荧光标记二抗的免疫组织化学检测质量控制规范
1 范围
本文件规定了基于荧光标记二抗的免疫组织化学检测的实验基本要求、操作程序和质量控制的技术要求。
本文件适用于病理实验室规范开展荧光标记二抗免疫组织化学检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 15066 不锈钢压力锅
GB 19781 医学实验室 安全要求
GB/T 23128 电磁灶
GB/T 29791.2 体外诊断医疗器械 制造商提供的信息（标示） 第2部分：专业用体外诊断试剂
GB 39707 医疗废物处理处置污染控制标准
JB/T 5479 荧光生物显微镜
QB/T 5546 载玻片 盖玻片
YY/T 1244 体外诊断试剂用纯化水
CNAS-CL02:2023 医学实验室质量和能力认可准则
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
免疫组织化学 immunohistochemistry；IHC
免疫细胞化学 immunocytochemistry；ICC
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记在抗体上的显色物质（荧光素、酶、金属离子、同位素、色原体）显色来检测组织细胞抗原，对其进行定位、定性及半定量的检测的技术。
[来源：YY/T 1181—2021，3.1]
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2
3.2
组织固定 tissue fixation
将组织浸入适宜的固定剂，使细胞和组织内的物质尽可能保持在其生活状态时的形态、结构和位置的过程。
3.3
抗体 antibody
由免疫原性物质刺激B-淋巴细胞产生，并能与免疫原性物质结合的特异性免疫球蛋白。
注：免疫原性物质的分子包含一种或多种带有独特化学成分的部分，即表位。
[来源：YY/T 0639—2019，3.1]
3.4
抗原 antigen
在免疫学中，凡能刺激机体免疫系统产生抗体，并能与其相应抗体发生特异性反应的物质。
3.5
抗原修复 antigen retrieval；AR
将组织蛋白内或蛋白之间因甲醛固定形成的交联打开，使之恢复到原有空间状态的过程。常用的方法包括酶修复法和热修复法。
3.6
荧光标记二抗 fluorescence labeled secondary antibody
将荧光基团耦联于二抗，即为荧光标记二抗。
3.7
阴性对照 negative control
不含已知目的抗原的组织或细胞片。
[来源：YY/T 1181—2021，3.4]
3.8
阳性对照 positive control
含有已知目的抗原的组织或细胞片。
[来源：YY/T 1181—2021，3.5]
4 缩略语
下列缩略语适用本文件。
DAPI：4’ , 6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（4’, 6-Diamidino-2-phenylindole，Dihydrochloride）
EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）
EDTA-Tris：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（Ethylenediamine Tetraacetic Acid-trishydroxymethylaminomethane）
FITC：荧光素5-异硫氰酸酯（Fluorescein Isothiocyanate）
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PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）
PBST：含吐温磷酸盐缓冲液（PBS-Tween）
TBST：含吐温Tris缓冲盐溶液（tTris Buffered Saline with Tween）
5 实验基本要求
5.1 人员要求
人员要求应符合CNAS-CL02:2023中6.2的要求。
5.2 实验室要求 基于荧光标记二抗的IHC检测实验室应符合《病理科建设与管理指南（试行）》的要求，实验室空间设置应考虑免疫组织化学染色机、纯水仪、电磁炉、蒸汽压力锅、恒温箱、生物显微镜等设备厂商要求，满足空间、温度、湿度、电源等指标，并按照GB 19781的要求对实验室进行充分的生物安全风险评估，针对生物、化学、放射及物理等危害制定防护性措施及合适的警告。 基本要求包括：
a)
应依据检测设备和检测过程要求，建立免疫组织化学检测实验室设施和环境要求；免疫组织化学实验室的空间和布局应与实验室活动相匹配，宜设立单独的免疫组织化学染色区域；
b)
有害试剂应在通风橱中操作；
c)
每年应对工作区进行有害气体浓度检测，保证有害气体浓度在规定许可的范围；
d)
染色水质应符合GB/T 6682的要求；
e)
相关医疗废弃物的处理应满足GB 39707的要求。
5.3 仪器和设备
5.3.1 IHC染色仪的基本要求 IHC染色仪应至少满足下列要求：
a)
液路系统：准确提供实验所需液体；
b)
机器清洁系统：染色切片达到一定数量时，机器提示系统清洁；
c)
控温系统：设备应具备恒定的控温系统；
d)
条码扫描系统：全自动识别试剂与玻片上的条码、试剂位，可读取打印的标签；
e)
组织保护系统：具有保证样本完整、不干片、试剂不蒸发的装置；
f)
试剂混合配置系统：在线配置试剂，无人工干预/预混；
g)
染色系统：预置染色标准程序，具备延时启动功能。 IHC染色仪应具备以下功能：
a)
试剂安全：有毒废液与无毒废液区分排放，方便科室收集有毒废液；
b)
软件要求：软件具备升级功能、数据储存功能、质量控制功能和打印功能，可与现行的病理科网络连接；
c)
报警及安全指标：设备监测指标异常、设备故障时具备报警功能。
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5.3.2 纯水仪 纯水仪的制水量和效率应满足实验室最大检测量的需求。纯水仪制备的纯水在性状、电导率、微生物总数、总有机碳、易氧化物方面应符合YY/T 1244的要求。
5.3.3 电磁炉和蒸汽压力锅 电磁炉应符合GB/T 23128的要求，蒸汽压力锅应符合GB 15066的要求。
5.3.4 荧光生物显微镜 实验室所用荧光生物显微镜应符合JB/T 5479的要求。
5.4 试剂要求 一抗、二抗和显色剂等的识别以及预期用途和检测方法原理应符合GB/T 29791.2的要求。含有荧光的试剂的包装应做好避光处理并标识有效期。
6 操作程序
6.1 组织前处理
6.1.1 组织固定
组织固定要求包括：
a)
常规固定应使用10%中性缓冲福尔马林（pH 7.2～pH 7.4）为固定液；
b)
固定液应充分覆盖组织标本，体积宜为组织大小的4倍～10倍；
c)
手术标本在离体后应及时剖开固定，在60 min之内完成；对于特殊样本，如胃癌标本，应在30 min内固定；细胞学及穿刺小组织标本应立即固定；
d)
固定时间根据组织大小，在6 h～48 h之间，直径小于2 mm的活检组织固定时间不应少于6 h，直径大于5 mm的组织固定时间宜在24 h～48 h；
e)
含骨组织应先充分固定后进行脱钙，使用含酸脱钙液脱钙后宜用pH 8.0～pH 10.0的EDTA缓冲液进行中和，以减少抗原因脱钙液而破坏。
6.1.2 组织脱水
组织脱水的要求包括：
a)
使用梯度乙醇脱水；
b)
脱水过程应缓慢进行，每种梯度乙醇的作用时间宜设定为60 min～120 min；
c)
在设定脱水程序之前，应进行脱水效果的有效性验证；
d)
脱水剂应定期或根据组织数量进行更换，确认达到脱水效果。
6.1.3 组织透明
组织透明的要求包括：
a)
透明程序宜使用二道透明剂，宜根据组织的类型和大小及脱水机的效率，每道时间应设置在15 min～60 min；
b)
透明剂的使用应在通风橱中进行；
c)
透明剂应定期或根据组织数量更换。
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6.1.4 组织浸蜡
组织浸蜡的要求包括：
a)
透明后的组织应经过2次～3次浸蜡程序，每次时间为30 min～90 min；
b)
建议使用熔点为56 ℃～58 ℃ 或58℃～60 ℃的优质切片石蜡，浸蜡温度控制在60 ℃～ 62 ℃；
c)
监控石蜡温度和石蜡缸内的容量，及时更换和补充石蜡。
6.1.5 组织包埋
组织包埋的要求包括：
a)
宜使用合适熔点的石蜡，同6.1.4的要求；
b)
在包埋组织时，应根据所处理组织的类型决定组织的包埋方向；
c)
每包埋一个盒子样本，应更换镊子，防止组织污染。
6.1.6 组织切片和烤片
切片和烤片的要求包括：
a)
切片厚度应为2 μm～4 μm；
b)
载玻片的选用应符合QB/T 5546的规定，采用粘附载玻片，捞片应平整无气泡，组织方向应一致；
c)
应根据烤片温度确定烤片时间，例如60 ℃～65 ℃烤片时间应控制在60 min～120 min，70 ℃～80 ℃烤片时间应控制在30 min～60 min，不应高温长时间烤片。
6.2 新鲜组织样本和细胞样本的前处理
前处理的要求包括：
a)
新鲜组织样本及时放入冷冻切片机内冷冻并切片；如不能及时处理，可放入-80 ℃冰箱或液氮中保存样本；
b)
新鲜组织样本冷冻切片后应及时固定。固定液应根据实验具体要求选择含有丙酮（10 min～20 min）、甲醛（10 min～20 min）或乙醇（5 min～10 min）的固定液，固定液量应充分，固定时间应适当；
c)
细胞样本应及时离心后涂片。涂片后及时放入含有丙酮（5 min～10 min）、甲醛（10 min～20 min）或乙醇（5 min～10 min）的固定液，固定液量应充分，固定时间应适当；
d)
细胞样本如需要制备成细胞蜡块，则离心沉淀后用滤纸或渗透性好的纸张包裹，放入10%中性缓冲福尔马林（pH 7.2～pH 7.4）固定液，余下要求同6.1。
6.3 染色前准备
6.3.1 染色手工操作流程 染色手工操作应满足以下要求：
a)
脱蜡、水化；
b)
抗原修复（可选择热修复方式或酶修复方式）；
c)
蒸馏水清洗；
d)
用IHC笔在距离组织2 mm～3 mm处画圈；
e)
PBST或TBST清洗3次，2 min/次；
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f)
滴加适量一抗和对照试剂，37 ℃ 1 h或4 ℃过夜(具体条件可根据一抗说明书进行)；
g)
PBST或TBST清洗3次，2 min/次；
h)
滴加适量二抗试剂（根据需求选取合适的荧光标记的二抗），37 ℃避光孵育20 min（具体条件可根据二抗试剂说明书中进行）；
i)
PBST或TBST清洗3次，2 min/次；
j)
滴加适量DAPI染细胞核，室温避光孵育（浓度和时间根据DAPI试剂说明书使用），细胞核复染也可采用含DAPI的封片剂（具体操作根据含DAPI的封片剂说明书进行），滴加含DAPI的封片剂后，直接跳至操作流程m）；
k)
蒸馏水清洗3次，2 min/每次；
l)
滴加抗荧光淬灭封片剂封片；
m)
荧光显微镜观察，拍照。
注：新鲜样本冷冻切片和细胞样本的实验操作流程从e）开始到m）结束。
6.3.2 染色后切片保存及荧光剂选择
染色后切片可在2 ℃～8 ℃短期保存一周。如需长期保存，可在-20 ℃保存12个月，保存期间应避免反复冻融。
在使用荧光试剂选择时，应根据实验目的和样品类型选择合适的荧光试剂。遵循荧光试剂的溶解、浓度选择、染色时间和观察分析等使用步骤。注意荧光试剂的保存条件，避免阳光直射和高温环境。在使用过程中遵守安全规定，避免直接接触皮肤和眼睛等。
6.4 染色的判读
6.4.1 染色结果的判定原则
染色结果应满足以下要求：
a)
应同时设立对照染色；
b)
抗原表达应在特定部位，且定位清晰准确，而无背景染色；
c)
组织的前处理不佳导致的抗原异位，此时不应判读为阳性；
d)
抗体的不同克隆号在不同组织中的定位不同，此时应标注阳性部位某些抗体在不同肿瘤类型表达的部位不同，此时应标注阳性部位。
6.4.2 染色结果的判读 荧光染色后，宜在1 h内完成观察，以保证最佳荧光显色效果，主要从定性和定位两个方面判读，结果判读应满足以下要求：
a)
阴性结果的判读应区分真阴性和假阴性，由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致假阴性反应；
注：荧光信号强度与待测标记物蛋白含量有关。建议参考内参细胞的蛋白表达荧光强度达到中等至强的信号强度。
b)
应区分在出血、坏死、刀痕和边缘细胞区域出现的非特异性的阳性信号，应结合形态学特征和病理诊断等分析免疫荧光染色结果；
c)
定性判读：免疫荧光染色结果判读过程中，多数染色结果的判读为定性。阳性是指在对照染色结果可信的前提下，信号出现在预期部位（分为细胞膜型、细胞质型、细胞核型、复合型四种阳性细胞类型），强度可以被观察到，反之则为阴性；
d)
半定量判读：参考组织化学评分（histochemistry score，H-SCORE），或结合染色强度与
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阳性细胞数积分进行综合判
读；
e)
有些抗原（如错配修复基因等）在正常组织普遍表达，而在特定的肿瘤中缺失表达。
注：组织或细胞的自发荧光不要误认为阳性表达。
7 质量控制
7.1 总则
7.1.1 质量控制主要包括室内质控和室间质控。
7.1.2 室内质控内容主要包括设备和试剂质控、组织处理质控、切片质控、抗原修复质控、对照质控和阅片质控等。
7.1.3 室间质评内容主要是监测分析本实验室与其他实验室检测结果间的一致性。
7.1.4 应定期对基于荧光标记二抗的IHC检测中资源要素和过程要素相关的质控数据进行监测和评价，从而保证检测报告的准确发出。
7.1.5 当室内质控失控时，实验室应根据其文件化程序采取适当措施以防止或预防风险的再次发生。
7.2 设备和试剂的质量控制
对设备和试剂的要求包括：
a)
临床样本的检测应选择具有注册证或备案证的体外诊断试剂；
b)
临床样本的检测应选择具有注册证的体外诊断设备，并定期进行检定、校准和维护；
c)
选择一抗时应了解不同抗体的特点，选择合适的抗体；
d)
二抗的选择应考虑与一抗的种属匹配，同时二抗标记的荧光基团应与实验室的荧光生物显微镜相匹配；同时标记多个抗原时，既应考虑一抗与二抗的种属匹配，也应选择合适波长的荧光基团，避免串色；
e)
选择的荧光标记二抗应与组织无交叉反应，以便最大程度减少非特异染色；
f)
实验室应按照试剂制造商说明储存和分装相关试剂和耗材，并监测相关的环境条件；
g)
新进抗体应进行抗体性能验证并填写抗体验证质控表，确定抗体效价、组织定位；不同批次/货号试剂应进行批间验证；
h)
荧光标记的选择：荧光标记的波长应尽量在肉眼可见范围内，避免无法肉眼观察（只能通过拍照软件曝光后拍照观察）造成的判读失误。封片时应选用专用的具有防淬灭功能的荧光封片剂；
i)
新进或维修后再次投入临床使用的设备，以及新货号或新批次试剂在实施常规临床检测之前应做性能验证或性能确认。
7.3 组织处理的质量控制 应满足6.1要求。
7.4 切片的质量控制
应满足6.2要求。
切片后应在2周内进行检测；4 ℃保存的切片应于1个月内进行检测。
7.5 抗原修复的质量控制 抗原修复的原则：选择合适的修复液，采用恰当的修复时间和修复温度，最大程度地暴露抗原
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表位，同时染色背景清晰，无非特异性染色。 影响热修复的因素包括修复液的pH值、修复时间和修复温度，抗原修复应满足以下要求：
a)
应根据实验室的验证结果或抗体说明书选用合适的修复液和修复条件；
b)
修复液pH值的选择：常用的修复液包括柠檬酸盐（Citrate）（pH 6.0）、 EDTA（pH 8.0）、 EDTA（pH 9.0）和EDTA-Tris（pH 9.0）等。应根据试剂说明书选择合适的pH值；
c)
抗原修复时间和修复温度的设定：应根据试剂说明书选择合适的抗原修复时间和修复温度。修复时间参照6.2 b）；
d)
酶消化过程与酶的浓度、活性、反应温度及pH密切相关，实验室应参考试剂说明书，根据阴性对照和阳性对照确认酶的浓度及活性，探究最佳孵育时间和温度；
e)
抗原修复过程中应保证切片维持湿润状态，避免切片干涸。
7.6 孵育条件的质量控制
孵育质控的要求包括：
a)
一抗和二抗的孵育环境应保持恒温恒湿，恒温箱宜控制在37 ℃，应在放入多个湿盒时仍能保证所有湿盒的恒温效果；
b)
二抗和DAPI的孵育应避光，以免荧光淬灭。
7.7 对照的质量控制 对照质控包括阳性对照和阴性对照，对照质控应注意：
a)
对于石蜡包埋样本，对照组织应与待检组织采取相同的程序进行固定、脱水、透明、浸蜡和包埋；
b)
对照组织应与待检组织采用相同的检测流程，如对照组织检测失败，那么本次检测流程视为无效；
c)
在实验过程中，宜采用弱表达组织作为阳性对照。
7.8 阅片的质量控制
阅片质控应满足以下要求：
a)
每批次染色完成后，应常规对染色的均匀性、背景噪音和染色效果等进行评价；
b)
阅片过程注意避光，以免荧光淬灭；
c)
荧光显微镜配置的滤光块应匹配二抗荧光基团的波长；
d)
荧光光源应在规定的使用时间范围内；
e)
实验室质量指标应包含切片染色的优良率，并定期监控。
7.9 室间质评
室间质评/实验室间对比包括：
a) 基于荧光标记二抗的IHC检测实验室应参考国家卫健委病理专业医疗质量控制指标（2024年版）设立免疫荧光染色室间质评合格率（指参加省级及以上病理质控中心、国际标准化组织或中国合格评定国家认可委等质控机构组织的室间质评）；
b)
室间质评不可获得的项目，可参考WS/T 415通过与其他实验室比对的方法确定结果的可接受性；
c)
实验室应确认室间质评/实验室间比对结果，当结果不合格时，应采取适当措施。
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参考文献
[1] GB/T 1.1—2020 标准化工作导则 第一部分：标准文件的结构和起草规则
[2] GB 29791.3—2013 体外诊断医疗器械 制造商提供的信息（标示） 第3部分：专业用体外诊断仪器
[3] YY/T 0639—2019 体外诊断医疗器械 制造商为生物学染色用体外诊断试剂提供的信息
[4] YY/T 1181—2021 免疫组织化学试剂盒
[5] YY/T 1579—2018 体外诊断医疗器械 体外诊断试剂稳定性评价
[6] YY/T 1652—2019 体外诊断试剂用质控物通用技术要求
[7] WS/T 415 无室间质量评价时实验室检测评估方法
[8] CNAS-GL021 医学领域定性检测能力验证实施指南
[9] CNAS-CL02-A001 医学实验室质量和能力认可准则的应用要求
[10] 《病理科建设与管理指南（试行）》（卫办医政发〔2009〕31号）