T/NAIA 0311-2024 支原体中西药MIC检测标准操作规程

ICS 65.020.30
CCS A 031
团体标准
T/NAIA 0311—2024
支原体中西药MIC检测标准操作规程
Standard Operating Procedures for MIC Detection of Mycoplasma in Traditional Chinese and Western Medicine
2024-10-02发布2024-10-20实施
宁夏化学分析测试协会 发布

前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。
本文件起草单位：宁夏农林科学院动物科学研究所、银川市畜牧技术推广服务中心、西吉县动物疾病预防控制中心、同心县科技局、隆德县动物疾病预防控制中心、固原市畜牧技术推广服务中心、平罗县农业农村局。
本文件主要起草人：郭亚男、王小龙、曹晓真、王建东、梁小军、邵喜成、伏耀明、马科、谢文青、摆世林、于有利、张久盘、张奎举、谢建亮、李毓华、岳康、王鑫、牛晓昊。
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支原体中西药MIC检测标准操作规程
1 范围
本文件规定了支原体中药和西药最小抑菌浓度检测技术的术语和定义、原理、标准操作规程、结果判断依据和操作注意事项。
本文件适用于鸡、牛和羊支原体。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 18597 危险废物贮存污染控制标准
CLSI M100-S22 抗生素敏感性检测操作标准
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
支原体 mycoplasma
柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属中的成员，结构较简单，无细胞壁，没有细胞核，仅有核糖体。
3.2
最小抑菌浓度 minimum inhibitory concentration (MIC)
一种在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。
3.3
颜色变化单位 color change unit (CCU)
以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的计数单位。
3.4
胸膜肺炎样微生物培养基 pleuropnenmonia-like organism medium PPLO
即支原体培养基，主要用于多种支原体的分离和培养。
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4 原理
支原体在PPLO培养基中生长产酸，将导致培养基颜色由红色变为黄色。当药物在培养基内能够对支原体的生长起到一定的抑制或杀灭作用时，培养基将维持红色。将药物进行倍比稀释测定支原体对药物的敏感性。药物完全抑制支原体生长的最高稀释管1mL所含的药量，即为最小抑菌浓度（MIC），亦即被测支原体对该药的敏感度。
5 操作程序
5.1 仪器与耗材
生物安全柜，二氧化碳培养箱，旋转蒸发仪，电磁炉，0.2mL无菌12连管，2mL无菌EP管，涡旋仪，冰箱，天平，高压消毒锅，移液器及枪头，0.22 μm微孔滤膜。
5.2 操作步骤
5.2.1 药液的制备
5.2.1.1西药配置
根据药物特性，用相应溶剂将抗菌药物溶解，然后用去离子水将药物稀释成1mg/mL的储存液，～80℃保存。使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。不同药物配置参照CLSI M100-S22执行。
5.2.1.2 中药配置
首先以10倍量水浸泡0.5h，大火沸腾后文火煎煮40min，过滤，保存滤液；滤渣再以8倍水量大火沸腾后文火煎煮30min，过滤，合并两次滤液，将滤液浓缩制成生药含量为1g/mL的浓缩液，-80℃保存。使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
5.2.2 菌株复苏、传代及CCU的测定
5.2.2.1将保存于-80℃含30%甘油的分离鉴定的支原体菌株的菌液吸取100μL接种于PPLO液体培养基中,置于37℃培养箱中进行复苏，培养48h～72h后吸取100μL菌液接种于PPLO液体培养基中进行传代培养，并测定菌株培养后的CCU。
5.2.2.2将支原体菌液用倍比稀释法稀释成1×101～1×1011倍比稀释液（共11管，第12管为对照），于37℃培养箱培养7d，以培养基由红色变为橙黄色时的最高稀释度作为颜色改变单位CCU，菌液浓度以CCU/mL计算。
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5.2.3 最小抑菌浓度的测定
5.2.3.1 菌液配置
通过倍比稀释将菌株稀释到103～105CCU/mL。因无支原体耐药性标准菌株不同药物耐药性标准，因此可以选用大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（ATCC）国际标准菌株为阳性参考模式菌株。避免假阳性的出现、试验操作误差及错误判断。
5.2.3.2 药物配置及操作
依据CLSI标准配置不同药物浓度，按照药物浓度进行药物敏感性测定（MIC）。在12连排管内，第2管～12管每管加入100 μL PPLO 液体培养基，第1管加入100 μL工作浓度的抗菌药，从1管中取100μL至第2管混匀，依次倍比稀释至第10管，弃去100 μL，使每管体积相同。第1～10各管加入100 μL 预先稀释好的菌液；第11管加入100 L菌液作为阳性对照；第12管不加菌液，作为阴性对照。每个样品3个重复。将12连排管盖密封，置于37℃培养箱中培养48h，在不同时间观察每个孔内颜色的变化并记录，并与阳性对照和阴性对照比较，不发生颜色变化的最小药物浓度为MIC（μg/mL）。
5.2.3.3结果测定
对受试细菌按测得的MIC值水平从低往高计算累积分布频数，然后计算累积分布率，最终测到MIC50和MIC90。
5.2.4 数据处理
采用SPASS软件对支原体菌株耐药性结果进行统计分析。
5.3结果判定
根据西药和中药的MIC值，将支原体对药物的敏感性分为敏感(Susceptible, S)、中度敏感(Intermediate, I)和耐药（Resistant, R），判断值参见附录C表C.2。当质控菌株对各药物表现敏感时，检测结果有效； 根据临床分离菌株的MIC值，确定支原体临床分离株的药物敏感性种类。
5.4 实验废弃物的处理
将实验所用的固体和液体废弃物分别集中收集到专用容器内，均按《医疗废物管理条例》进行121C、30 min高压灭菌处理。含抗生素的试验废弃物，按GB 18597标准中的相关要求进行收集和贮存，由具有资质的专业机构进行收集、转移和处理。
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附录A
（规范性）
试剂配制
本附录规定了西药和中药工作浓度的配制方法以及支原体培养基的配制方法，以下试剂除特殊说明外，均为分析纯。
A.1 抗菌药配制
A.1.1 注意事项
a) 鉴于多种抗菌药均为复合盐类，并有纯度标识，配制时，应扣除杂质部分和辅助基团质量，只考虑 纯活性组分的实际浓度。如：含1个水的盐酸卡纳霉素纯度为98%，分子量为582.58 g/mol；而卡那霉素基团的分子量为484.50 g/mol，校正系数为484.50/582.58 (98%=0.815)。即称取5 mg含1个水的盐酸卡那霉素时，只相当于4.075 mg环丙沙星基团（5 mg*0.815=4.075mg）。将5 mg盐酸卡那霉素溶于4.075 mL水中，得到1 mg/mL的贮存液；
b) 不同抗菌药需要不同的溶剂溶解。操作时，先用少量合适溶剂溶解，再用去离子水稀释成贮存浓度 为1mg/mL；
c) 抗菌药溶液定容前，将pH值调至7.8，以避免导致支原体培养物出现非特异性颜色变化；
d) 所有抗菌药溶液配成贮存浓度后，均经0.22 μm的微孔滤器过滤除菌。贮存液保存于～80 ℃备用，工作液保存于4℃备用。
A.1.2 西药溶剂和稀释液的配制
参照 CLSI M100-S22 配制，具体见表 A.1.1。
表A.1.1 抗菌药贮存液与工作液配制所选择的溶剂和光敏感性
药物类别
药物名称
溶剂
稀释液
贮存液浓度mg/mL
工作液浓度μg/mL
光敏感性
环丙沙星 Ciprofloxacin
水
水
1
32
是
达氟沙星 Danofloxacin
水
水
1
16
是
恩诺沙星
Enrofloxacin
0.1M氢氧化钠
水
1
32
是
喹诺酮类
马波沙星Marbofloxacin
水
水
1
64
是
大环内酯类
泰乐菌素
水
水
1
32
否
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5
tylosin
托拉菌素 tulathromycin
0.015M柠檬酸
水
5
1024
否
阿奇霉素
azithromycin
0.1M乙酸
水
1
64
否
红霉素
Erythromycin
95% 乙醇
水
1
64
是
地红霉素 Dirithromycin
0.1M乙酸
水
1
128
否
罗红霉素Roxithromycin
95% 乙醇
水
1
64
否
替米考星
Tilmicosin
0.01M盐酸
水
1
512
是
螺旋霉素
Spiramycin
95%乙醇
水
1
512
否
妥布霉素
Tobramycin
水
水
1
64
否
庆大霉素
Gentamicin
水
水
1
256
否
壮观霉素Spectinomycin
水
水
1
256
否
氨基糖苷类
卡那霉素
Kanamycin
水
水
1
32
是
氟苯尼考
Florfenicol
95%乙醇
水
1
32
否
苯丙醇
甲砜霉素 Thiamphenicol
95%乙醇
水
3
512
是
四环素
Tetracycline
水
水
1
16
是
多西环素
Doxycycline
水
水
1
32
是
四环素类
金霉素 Chlortetracycline
0.01M盐酸
水
1
64
是
林可胺酰胺类
林可霉素
Lincomycin
水
水
1
32
否
甘氨酰环素
替加环素
Tigecycline
水
水
1
128
否
双萜烯类
泰妙菌素
Tiamulin
95% 乙醇
水
1
128
是
氟奎诺酮类
恩诺沙星
Enrofloxacin
0.01M盐酸
水
1
128
否
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A.1.3 中药溶剂和稀释液的配制
表A.1.2 中药贮存液与工作液配制所选择的溶剂
药物名称
溶剂
稀释液
贮存液浓度g/mL
工作液浓度μg/mL
光敏感性
知母
水
水
1
125
否
桔梗
水
水
1
62.5
否
甘草
水
水
1
250
否
川芎
水
水
1
500
否
当归
水
水
1
1000
否
冬花
水
水
1
125
否
枳壳
水
水
1
500
否
浙贝
水
水
1
500
否
苏籽
水
水
1
500
否
厚朴
水
水
1
62.5
否
生姜
水
水
1
1000
否
柴胡
水
水
1
250
否
杏仁
水
水
1
1000
否
紫苏
水
水
1
250
否
黄连
水
水
1
31.5
否
茯苓
水
水
1
1000
否
穿心莲
水
水
1
125
否
黄芩
水
水
1
32.5
否
鱼腥草
水
水
1
7.81
否
麻黄
水
水
1
62.5
否
板蓝根
水
水
1
500
否
党参
水
水
1
1000
否
黄柏
水
水
1
15.63
否
苦参
水
水
1
15.63
否
百部
水
水
1
250
否
金银花
水
水
1
500
否
红花
水
水
1
500
否
大青叶
水
水
1
1000
否
A.2 支原体液体培养基
PPLO肉汤粉21 g，酵母粉 2.5 g，丙酮酸钠 1 g，葡萄糖0.2 g溶于800 mL双蒸水中，121 ℃ 高压灭菌20 min后，添加马血清200 mL，8万单位青霉素0.1 g，0.05 %酚红1 mL，4℃保存。
A.3 支原体固体培养基
PPLO琼脂粉30 g，酵母粉 2.5 g，丙酮酸钠 1 g，葡萄糖0.2 g溶于800 mL双蒸水中，121 ℃ 高压灭菌20 min后，添加马血清200 mL，8万单位青霉素0.1 g，0.05 %酚红1 mL，4℃保存。
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附 录B
（资料性）
支原体颜色变化单位测定方法
B.1 支原体颜色变化单位的测定
取12支1.5 mL的EP管，每管加入900 μL的PPLO液体培养基，然后在第1管中加入100 μL已复苏的待测菌液，充分混匀后，吸取100 μL加入第2管，混匀，再吸取100 μL加入第3管，依此类推，到最后1管。置于普通培养箱中37℃培养48 h～72 h，观察培养液的颜色变化，以最后出现颜色变化的1管为判定标准，即如果第5管为最后发生颜色变化管，则颜色变化单位为105 CCU/mL。
B.2 牛津杯法体外药敏试验
将纯化鉴定后的保存的菌株复苏液 1:1 000 稀释后均匀涂布在加有酚红指示剂以及支原体生长所需各种营养物质的固体培养平板上，待菌液稍干后，用无菌镊子夹取灭菌过的牛津杯，与火焰上轻微灼烧灭菌后轻轻垂直放于培养基表面，用微量移液器在牛津杯内注入100μL无菌中药液，置于 37℃恒温箱中培养48h，测定抑菌圈大小并判定敏感性。
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附 录C
（规范性）
药物敏感性判断标准
C.1 药物MIC检测
采用微量肉汤稀释法测定支原体MIC。在96孔板内依次倍比稀释药物，然后分别吸取100μL对应在加入12连管中，再加入等体积适当稀释的支原体液培养物，置于37℃普通培养箱中培养48 h，观察每个孔内颜色的变化并记录，不改变颜色的药物最高稀释倍数对应管的抗菌药浓度（μg/mL）即为MIC。
C.2 药物敏感性判断标准
根据MIC值将支原体对所测药物的敏感性分为敏感(Susceptible, S)、中度敏感(Intermediate, I)和耐 药（Resistant, R）。各西药的具体判断值见表C.1，各中药的具体判断值见表C.2.
表C.1 支原体对各种西药敏感性判断值
药物浓度（μg/mL）
药物类别
药物名称
敏感
中介
耐药
环丙沙星 Ciprofloxacin
≤1
2
≥4a
达氟沙星 Danofloxacin
≤1
2-4
＞8a
喹诺酮类
恩诺沙星 Enrofloxacin
≤1
2-4
＞8a
泰乐菌素
tylosin
≤0.5
1-4
≥8
托拉菌素 tulathromycin
≤16
32
≥64
阿奇霉素 azithromycin
≤2
4
≥8
红霉素 Erythromycin
≤2
4
≥8
地红霉素 Dirithromycin
≤2
4
≥8
罗红霉素Roxithromycin
≤2
4
≥8
替米考星 Tilmicosin
≤2
4
≥8
大环内酯类
螺旋霉素 Spiramycin
≤2
4
≥8
妥布霉素 Tobramycin
≤4
8
≥16a
氨基糖苷类
庆大霉素 Gentamicin
≤4
8
≥16
氨基糖苷类
壮观霉素
≤4
8
≥16
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Spectinomycin
卡那霉素
Kanamycin
≤4
8
≥16
氟苯尼考 Florfenicol
≤2
4
≥8
苯丙醇
甲砜霉素 Thiamphenicol
≤8
16
≥32
四环素 Tetracycline
≤4
8
≥16a
多西环素 Doxycycline
≤4
8
≥16a
四环素类
金霉素 Chlortetracycline
≤4
8
≥16
林可胺类
林可霉素 Lincomycin
≤2
-
≥4
甘氨酰环素
替加环素 Tigecycline
≤2
-
≥4
双萜烯类
泰妙菌素
Tiamulin
≤0.5
1-4
≥8
氟奎诺酮类
恩诺沙星Enrofloxacin
≤4
8
≥16
表C.2 支原体对各种中药敏感性判断值
药物浓度（μg/mL）
药物名称
敏感
中介
耐药
知母
≤64
-
≥128
桔梗
≤64
-
≥128
甘草
≤64
-
≥128
川芎
≤64
-
≥128
当归
≤64
-
≥128
冬花
≤64
-
≥128
枳壳
≤64
-
≥128
浙贝
≤64
-
≥128
苏籽
≤64
-
≥128
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厚朴
≤64
-
≥128
生姜
≤64
-
≥128
柴胡
≤64
-
≥128
杏仁
≤64
-
≥128
紫苏
≤64
-
≥128
黄连
≤64
-
≥128
茯苓
≤64
-
≥128
穿心莲
≤64
-
≥128
黄芩
≤64
-
≥128
鱼腥草
≤64
-
≥128
麻黄
≤64
-
≥128
板蓝根
≤64
-
≥128
党参
≤64
-
≥128
黄柏
≤64
-
≥128
苦参
≤64
-
≥128
百部
≤64
-
≥128
金银花
≤64
-
≥128
红花
≤64
-
≥128
大青叶
≤64
-
≥128