T/NAIA 0320-2024 化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物的测定 高效液相色谱法

ICS 71.100.70
CCS C 268
团体标准
T/NAIA 0320-2024
化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物的测定高效液相色谱法
Determination of Rutin and other flavonoid in cosmeticsBy High-performance liquid chromatography
2024-10-02发布 2024-10-20实施
宁夏化学分析测试协会 发布

前 言
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由宁夏回族自治区药品检验研究院提出。
本文件由宁夏化学分析测试协会归口。
本文件起草单位：宁夏回族自治区药品检验研究院（国家枸杞产品质量检验检测中心
(宁夏))、宁夏回族自治区药品质量控制与评价重点实验室、宁夏卫生健康职业技术学院、宁夏工商职业技术学院。
本文件主要起草人：肖哲丽、王宁、王宁霞、马玲、尚博扬、翟宇、武亦融、王荣、贺凯、刘永衡、马宗卫。
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化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物的测定
高效液相色谱法
Determination of Rutin and other flavonoid in cosmetics
By High-performance liquid chromatography
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范围
本文件规定了高效液相色谱法测定化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物含量的测定方法。
本文件适用于水剂类、乳液类、膏霜类、贴面面膜类化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物的定性与定量测定。
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规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
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术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4
原理
样品经80%甲醇水溶液超声提取后，采用高效液相色谱系统分离，二极管阵列检测器（DAD），在波长360nm处检测，根据保留时间和紫外光谱定性，外标法定量。
5
试剂与材料
除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的一级水。
5.1
甲醇：色谱纯。
5.2
磷酸：H3PO4，色谱纯。
5.3
80%甲醇溶液：准确量取800mL甲醇于1L容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后备用。
5.4
0.1%磷酸溶液：准确量取1.0mL磷酸于1L容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后备用。
5.5
标准品
芦丁（CAS号153-18-4）、杨梅酮（CAS号529-44-2）、异鼠李素-3-O-β-D-芸
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香糖苷（CAS号604-80-8）、槲皮素（CAS号117-39-5）、木樨草素（CAS号491-90-3）、山奈酚（CAS号520-18-3）标准品：纯度≥91%。
5.6
标准品溶液配制
5.6.1
标准储备溶液：分别精密称取芦丁、杨梅酮、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷，槲皮素、木樨草素、山奈酚标准品各10mg(精确至0.01mg)，分别置于10mL容量瓶中，用适量甲醇（5.1）溶解并定容至刻度，摇匀，配制成1000mg/L标准储备溶液，于4℃避光保存，可使用三个月。
5.6.2
混合标准储备溶液：分别准确移取上述标准储备溶液（5.6.1）各2.5mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为50mg/L的混合标准储备溶液，临用现配。
5.6.3
混合标准工作溶液：分别准确量取混合标准储备溶液（5.6.2）0.2mL、0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL用甲醇稀释至10mL，得到浓度为1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50μg/mL的混合标准工作溶液（混合标准工作溶液范围可根据实际情况进行调整），临用现配。标准溶液色谱图见附录A。
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仪器与设备
6.1
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2
分析天平：感量0.00001g。
6.3
超声波清洗器。
6.4
超纯水机。
6.5
多管涡旋混合仪。
6.6
微孔滤膜：0.45μm，有机系。
7
样品处理
准确称取化妆品试样0.5g(精确到0.0001g)于10mL具塞比色管中（若试样为贴面面膜类样品应取液体部分），加入约6mL的80%甲醇溶液，涡旋震荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20min，冷却至室温，加入80%甲醇溶液定容至10mL，经孔径为0.45μm有机微孔滤膜过滤后，滤液作为样品待测溶液。
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测定条件
8.1高效液相色谱参考条件如下：
a) 色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm,5μm），或等效色谱柱；
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b) 柱温：25℃；
c) 流动相：A:0.1%磷酸（5.4），B:甲醇（5.1）,见表1；
d) 检测波长：360nm；
e) 流速：0.8mL/min；
f) 进样量：10μL。
表1梯度洗脱程序
时间（min）
流动相A（%）
流动相B（%）
0
51
49
10
51
49
13
30
70
20
30
70
23
51
49
28
51
49
8.2
测定
在“8.1”项下色谱条件下，取“5.6.3”项下混合标准工作溶液分别进样，进行液相色谱分析，以混合标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
取“样品处理”项下的待测溶液，进行色谱分析，根据相对保留时间和紫外光图谱定性，外标法定量计算待测溶液中各组分的浓度。按“9”计算样品中各组分的含量（试样中各组分的响应值均应在标准曲线范围内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析）。
9
分析结果的表述
试样中芦丁、杨梅酮、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷，槲皮素、木樨草素、山奈酚6种黄酮类化合物的含量按以下公式计算：
ω=?×?×??×1000 ...............（1）
式中：ω——试样中芦丁等6种黄酮类化合物含量的数值，单位为毫克每克（mg/g）；
ρ——代入标准曲线测得试样中芦丁等6种黄酮类化合物的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
m——试样的质量，单位为克（g）；
V——试样中加入并定容的提取溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
D——为稀释倍数；
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注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
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精密度
在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。
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其他
本方法对芦丁、杨梅酮、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷，槲皮素、木樨草素、山奈酚6种黄酮类化合物的检出限均为2μg,定量下限均为10μg，当取样量为0.5g时，检出浓度为4μg/g,最低定量浓度为20μg/g。
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附录A
（资料性）
芦丁、杨梅酮、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷，槲皮素、木樨草素、山奈酚6种黄酮类化合物标准品色谱图
图A.混合标准溶液色谱图
1:芦丁（8.223min）;2:杨梅酮（11.541min）;3:异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷（12.966min）;
4:槲皮素（19.031min）;5:木樨草素（20.116min）;6:山奈酚（21.177min）