SN/T 3558-2025 国境口岸马尔堡病毒检验

　　ICS 11. 020

CCS C 62

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 3558—2025

代替SN/T 3558—2013

2025‑07‑25 发布2026‑02‑01 实施

国境口岸马尔堡病毒检验

Test methods for Marburg virus at frontier ports

中华人民共和国海关总署　　发　布

SN/T 3558—2025

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件代替SN/T 3558—2013《马尔堡病毒RT‑PCR 和实时荧光RT‑PCR 检测方法》，与SN/T

3558—2013 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

——更改了马尔堡病毒实验室检测的生物安全要求(见第5 章，2013 年版的第5 章);

——更改了马尔堡病毒荧光RT‑PCR 检测方法GP 基因片段引物探针(见附录B 中表B.1，2013 年

版的9.2 中表1);

——更改了马尔堡病毒RT‑PCR 和荧光RT‑PCR 检测方法(见附录A 中表A.1、附录B 中B.4.2，

2013 年版的8.2，9.4.1);

——更改了荧光RT‑PCR 检测方法结果判定与报告(见附录B 中B.5，2013 年版的9.5)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国广州海关技术中心、中国科学院武汉病毒研究所。

本文件主要起草人：洪烨、袁帅、蔡扬尧、师永霞、戴俊、郑夔、黄吉城、邓燕凤、袁志明、黄弋、相大鹏。

本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：

——2013 年首次发布SN/T 3558—2013;

——本次为第一次修订。

Ⅰ

SN/T 3558—2025

引言

马尔堡出血热是由马尔堡病毒引起的以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经密

切接触传播，传染性强，病死率高。

现有标准如SN/T 1231—2010《国境口岸埃博拉出血热和马尔堡出血热疫情监测与控制规程》仅提

供了国境口岸马尔堡出血热的监测对象、疫情监测、疫情控制、疫情报告和个人防护原则;SN/T 1311—

2003《马尔堡病检测方法》仅提供了针对马尔堡病抗体水平的检测方法，未提供分子生物学检测方法。

Ⅱ

SN/T 3558—2025

国境口岸马尔堡病毒检验

1 范围

本文件规定了国境口岸马尔堡病毒分子生物学检验的检验对象，生物安全和PCR 防污染要求，样本

采集、运送与保存，检验方法与结果报告，描述了相应的检验方法。

本文件适用于对国境口岸可疑病人进行马尔堡病毒检验。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

文件。

GB 19489　实验室生物安全通用要求

WS/T 230　实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南

病原微生物实验室生物安全管理条例

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

马尔堡病毒 Marburg virus

属丝状病毒科，病毒基因组为单股负链RNA，长约19 kb，编码7 种病毒蛋白，包括N 蛋白(NP)、病

毒蛋白35(VP35)、病毒蛋白30(VP30)、病毒蛋白24(VP24)、糖蛋白4(gp4)、RNA 依赖的RNA 聚合酶

主要成分糖蛋白7(gp7)和次要成分病毒蛋白40(VP40)。

3.2

马尔堡病毒病 Marburg virus disease

由马尔堡病毒(Marburg virus)引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经

密切接触传播，传染性强，病死率高。

注： 由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热。

3.3

逆转录-聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction

聚合酶链反应的一种广泛应用的变形。在逆转录-聚合酶链反应中，由一条RNA 单链转录为互补

DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA 的DNA 聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA 的另一条链

通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA 的DNA 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA

模板被RNA 酶降解，留下互补DNA。

3.4

实时荧光逆转录-聚合酶链反应 real‑time reverse transcription polymerase chain reaction

逆转录-聚合酶链反应扩增过程中，通过引入荧光化学物质，每经过一个循环，收集一个荧光强度信

号，通过对逆转录-聚合酶链反应扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板

1

SN/T 3558—2025

定量及定性的分析。

4 检验对象

4.1 马尔堡病毒病留观病例、疑似病例和确诊病例。

4.2 其他申请马尔堡病毒检验的人员样本。

5 生物安全和PCR 防污染要求

实验室生物安全应符合GB 19489 和《病原微生物实验室生物安全管理条例》的规定。PCR 防污染

措施按WS/T 230 的规定执行。

马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全三级(BSL‑3)实验室内进行。

马尔堡病毒相关的灭活材料的操作在生物安全二级(BSL‑2)实验室内进行。

马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为A 类，UN 编号为UN2814，采用三层包装系统。

6 样本采集、运送与保存

6.1 样本采集

静脉采集疑似病人抗凝全血3 mL。采血后立即颠倒混匀，使抗凝剂与血液充分混合。采血管上应

有个人信息的唯一性标识。置4 ℃冰箱冷藏，并尽快低温运送到实验室待进一步检测。

6.2 样本的运送与保存

样本于2 ℃~8 ℃下运送至实验室检测。上述样本如72 h 内不能送到实验室，应置于-70 ℃保存。

样本运输应按照相关生物安全规定，采取三层包装系统A 类包装，低温冷藏运输，避免反复冻融。

7 检验方法与结果报告

马尔堡病毒RT‑PCR 检验及结果报告按附录A 进行;实时荧光RT‑PCR 检验及结果报告按附录B

进行。其他通过性能验证的商品化试剂盒也可使用，按照试剂盒说明书进行。

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SN/T 3558—2025

附录A

(规范性)

马尔堡病毒的RT‑PCR 检测

A.1 主要设备

主要设备如下：

——PCR 扩增仪;

——千分之一天平;

——二级生物安全柜;

——高压灭菌锅;

——低温高速离心机：最大离心力20 000g ;

——电泳仪;

——凝胶成像分析系统;

——漩涡振荡器;

——移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和1 mL。

A.2 主要试剂

主要试剂如下：

——核酸提取试剂;

——RT‑PCR 基础试剂;

——检测引物(见表A.1)。

表A.1　马尔堡病毒RT‑PCR 检测引物

引物名称

MBGV‑FP

MBGV‑RP

注：预期扩增片段为381 bp。简并碱基中M 为A 或C;Y 为C 或T。

序列(5′‑3′)

AAATGTCCAAACACTYGCAGAAGC

GCACAATCMGGTGGGTTATTTCG

A.3 核酸提取

参照核酸提取试剂说明书进行。

A.4 RT‑PCR 反应

A.4.1 反应体系

反应体系为50 μL，按照表A.2 进行配制。

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SN/T 3558—2025

表A.2　RT‑PCR 反应体系

成分

2×One Step Mix

One step Enzyme Mix

MBGV‑LuP

MBGV‑LdP

RNA/模板

DEPC 水

加样量(体积/浓度)

25 μL

2.5 μL

0.4 μmol/L

0.4 μmol/L

5 μL

补充至总体积50 μL

A.4.2 扩增程序

50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 1 min ，30 个循环;4 ℃保

存。反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。

A.4.3 阳性对照、阴性对照和空白对照设置

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据马尔堡病毒相应扩增片段经人

工合成并体外转录的模板RNA(序列参见附录C);阴性对照为正常人标本;空白对照为DEPC 水。

A.5 凝胶电泳

扩增结束后，在5 μL 扩增产物中加入1 μL 6×DNA 上样缓冲液，用含10 000×DMSO 核酸凝胶染料

去染1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。

A.6 结果判定

A.6.1 质量控制

反应结果应同时符合以下两个条件：

——阴性对照、空白对照无扩增条带;

——阳性对照出现预期380 bp 大小的扩增条带。

A.6.2 结果判定与报告

当同时进行的阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果正常时，本方法检验结果判定和报告如下：

——未出现预期380 bp 大小的扩增条带，报告“未检出马尔堡病毒特异性基因(RT‑PCR 法)”;

——出现预期380 bp 大小的扩增条带，报告“检出马尔堡病毒特异性基因(RT‑PCR 法)”。

A.6.3 病毒测序

对于首发病例，应将PCR 扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用BLAST 分析其与已公布

的马尔堡病毒序列的同源性，判断扩增产物是否为马尔堡病毒核酸。也可采样二代测序技术进行全基因

组测序，以确定病毒的基因型和变异情况。

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SN/T 3558—2025

附录B

(规范性)

马尔堡病毒的实时荧光RT‑PCR 检测

B.1 主要设备

主要设备如下：

——荧光定量PCR 仪;

——二级生物安全柜;

——高压灭菌锅;

——低温高速离心机：最大离心力20 000g ;

——漩涡振荡器;

——冰箱：4 ℃、-20 ℃和-70 ℃;

——移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和1 mL。

B.2 主要试剂

主要试剂如下：

——核酸提取试剂;

——实时荧光RT‑PCR 基础试剂;

——检测引物和探针(见表B.1)。

表B.1　马尔堡病毒实时荧光RT‑PCR 检测引物和探针

引物/探针名称

MGBV‑UP

MBGV‑DP

MBGV‑Pro

mnp‑F

mnp‑R

mnp‑Probe

简并碱基中R 为A 或G;Y 为C 或T;I 表示脱氧次黄嘌呤。等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也

可使用

序列(5′‑3′)

TTTGGGAARTTRCCITATCGTGT

AACCATCATRTTRCTIGGGAATGC

FAM‑CAGAAATGTCCAAACACTYGCAGAAGC‑BHQ1

GGTCAAACTAGATTCTCAGGACTTC

GTCACCCCTGAATCAGTTTTTT

FAM‑TGTGAAAACAGTTCTCGAGTTCATC‑BHQ1

扩增片段

L 基因片段，预期扩增片段为99 bp

NP 基因片段，预期扩增片段为80 bp

B.3 核酸提取

参照核酸提取试剂说明书进行。

B.4 实时荧光RT‑PCR 反应

B.4.1 反应体系

靶目标为L 基因，使用Ag‑Path‑IDTM One step RT‑PCR kit 进行体系配置，反应体系为20 μL;靶目

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SN/T 3558—2025

标为NP 基因使用One step RT‑PCR kit 进行体系配置，反应体系为25 μL。分别按照表B.2、表B.3 进行

配制。

表B.2　实时荧光RT‑PCR 反应体系(L 基因)

成分

2×RT‑PCR 缓冲液

MGBV‑UP

MBGV‑DP

MBGV‑Pro

25×RT‑PCR Enzyme Mix

RNA/模板

DEPC 水

加样量(体积/浓度)

10 μL

0.5 μmol/L

0.5 μmol/L

0.25 μmol/L

0.8 μL

6.2 μL

补足至总体积20 μL

表B.3　实时荧光RT‑PCR 反应体系(NP 基因)

成分

5×RT‑PCR 缓冲液

mnp‑F(10 μmol/L)

mnp‑R(10 μmol/L)

mnp‑Probe(5 μmol/L)

RT‑PCR Enzyme Mix

RNA/模板

DEPC 水

总体积

体积/μL

5

1

1

0.5

1

3

13.5

25

B.4.2 扩增程序

L 基因(以ABI Q6 荧光定量PCR 仪为例)：反应条件为50 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，然后按95 ℃ 5 s，

58 ℃ 45 s 进行45 个循环的扩增和荧光信号采集，最后用仪器自动进行结果分析。

NP 基因(以Roche LightCycler 或BioRad DNA EngineOpticon 为例)：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min;

95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s(收集荧光信号)，45 个循环。

在不同的荧光定量PCR 仪上，TaqMan 探针实时荧光RT‑PCR 的反应条件略有不同。反应参数可根

据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。

B.4.3 阳性对照、阴性对照和空白对照设置

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据马尔堡病毒相应扩增片段经人

工合成并体外转录的模板RNA(序列参见附录C);阴性对照为正常人样本;空白对照为DEPC 水。

6

SN/T 3558—2025

B.5 结果判定

B.5.1 质量控制

反应结果应同时符合以下两个条件：

——阴性对照、空白对照无扩增曲线;

——阳性对照Ct 值≤35 并有明显扩增曲线。

B.5.2 结果判定与报告

当同时进行的阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果正常时，本方法检验结果报告如下：

——无明显扩增曲线，判为阴性，报告“未检出马尔堡病毒特异性基因(实时荧光RT‑PCR 法)”;

——有明显扩增曲线，且Ct 值≤40，判为阳性，报告“ 检出马尔堡病毒特异性基因(实时荧光

RT‑PCR 法)”;

——有明显扩增曲线，且40

显的对数增长期，报告“检出马尔堡病毒特异性基因(实时荧光RT‑PCR 法)”;

——本文件制定了针对L 基因和NP 基因检测方法，任一基因检出阳性，则报告“检出马尔堡病毒特

异性基因(实时荧光RT‑PCR 法)”。

B.5.3 病毒测序

实时荧光RT‑PCR 结果阳性的标本可进一步进行RT‑PCR 扩增。对于首发病例，应对扩增片断进

行序列测定和比对，确认是否为马尔堡病毒核酸阳性。也可采样二代测序技术进行全基因组测序，以确

定病毒的基因型和变异情况。

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附录C

(资料性)

马尔堡病毒阳性对照GenBank 参考序列编号及序列

C.1 马尔堡病毒阳性参考序列(L 基因)

参考序列GenBank 编号：JX458827.1，部分特征序列如下：

ACTTTTGGGAAATTACCGTATCGTGTCAGAAATGTCCAAACACTCGCAGAAGCTTTGCTA

GCAGATGGACTAGCAAAAGCATTCCCTAGTAACATGATGGTTGTCACTGAGAGGGAACAGAA

AGAAGCTTTATTGCATCAGGCTTCTTGGCACCACAATTCAGCAAGCATAGGGGAAAACGCCA

TAGTGAGGGGTGCGAGTTTTGTTACTGATCTTGAGAAATACAACCTTGCCTTCCGATATGAA

TTTACACGGCATTTCATAAACTACTGTAATCGATGTTATGGTGTGAAGAATTTATTCGATTG

GATGCACTTTTTAATACCACTATGTTATATGCATGTCAGTGATTTTTATAGCCCACCACATT

GTGTGACAGAAGATAACCGAAATAACCCACCTGATTGTGCTAAT

C.2 马尔堡病毒阳性参考序列(NP 基因)

参考序列GenBank 编号：JX458827.1，部分特征序列如下：

GGTCAAACTAGATTCTCAGGACTTCTTATTGTGAAAACAGTTCTCGAGTTCATCTTG

CAAAAAACTGATTCAGGGGTGAC

8

SN/T 3558—2025

参考文献

[1] WS/T 313　医务人员手卫生规范

[2] WS/T 573　感染性疾病免疫测定程序及结果报告