SN/T 5763-2025 暗色刺参鉴定方法 荧光PCR法

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 5763—2025

暗色刺参鉴定方法 荧光PCR 法

Identification for Isostichopus fuscus— Real-time PCR method

2025-07-25 发布2026-02-01 实施

中华人民共和国海关总署发 布

前 言

本文件按照GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国杭州海关。

本文件主要起草人：吴姗、方云、何永强、张晓峰、虞惠贞、张明哲、尹文秀、张荃、沈旭芳、

应正平、李炎锟。

 

1　范围

本文件描述了暗色刺参(Isostichopus fuscus)的实时荧光PCR 鉴定方法。

本文件适用于暗色刺参及以暗色刺参为原料的食品、保健品中暗色刺参成分的定性鉴定。

2　规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适

用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3　术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4　缩略语

下列缩略语用于本文件。

bp：碱基对(base pair)。

COI 基因：高等生物细胞中线粒体的细胞色素C 氧化酶亚基I(cytochrome C oxidase subunit I gene)。

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)。

DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)。

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)。

FAM：6- 羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)。

Na2-EDTA：二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)。

OD：光密度值(optical density)。

PCR: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。

ROX：羧基-X- 罗丹明(carboxy-X-rhoa mine)。

Taq 酶：从水生热栖菌中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶(thermus aquaticus)。

TE：Tris-HCl、EDTA 缓冲液。

Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris (hydroxymethyl) aminomethane]。

5　方法原理

用暗色刺参物种特异性引物及探针对暗色刺参DNA 进行实时荧光PCR 扩增，根据扩增曲线与Ct

值进行判定，实现对暗色刺参物种的鉴定。

6　仪器设备

6.1 实时荧光PCR 仪。

6.2 恒温水浴锅或干式恒温器。

6.3 离心机：最大离心力不小于16 000 g。

2

6.4 微量移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。

6.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.6 pH 计。

6.7 涡旋振荡仪。

6.8 天平：感量0.01 g。

6.9 高压灭菌器。

7　试剂和材料

7.1　试剂级别

除另有规定外，所有试剂为分析纯试剂。试验用水应符合GB/T 6682 中二级水的要求。

7.2　化学试剂

氢氧化钠溶液(10 mol/L)，Na2-EDTA 溶液(0.5 mol/L，pH 8.0)，Tris-HCl 溶液(1 mol/L，pH 8.0)，

CTAB 裂解液(2.0%)，CTAB 沉淀液(0.5%)， 蛋白酶K 溶液(20 mg/mL)，NaCl 溶液(1.2 mol/L)，

RNase A 酶，三氯甲烷，异丙醇，70% 的乙醇，TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;1 mmol/L Na2-

EDTA 缓冲液，pH 8.0)。试剂配制方法按照附录A 执行。

7.3　分子生物学试剂

实时荧光PCR 反应混合液，试剂配制方法按照A.9 执行，也可使用商品化的预混液。

7.4　引物和探针

上游引物F ：5’CAGCTGGAGGAGGAGACC3’

下游引物R ：5’GGGCTCAGACTAGGAATCC3’

探针P ：5’FAM-TCTTCCTGGGTTTGGAATGA-ECLIPSE3’

扩增的目的基因为线粒体的COI 基因，扩增片段长度204 bp，扩增的靶标序列见附录B。

7.5　质控品

7.5.1 阳性质控品：含暗色刺参成分的样品或含有PCR 扩增目的片段的阳性质粒。

7.5.2 阴性质控品：不含暗色刺参成分或DNA 的样品。

7.5.3 空白质控品：无菌双蒸水。

8　实验步骤

8.1　制样

8.1.1 干海参：先用水泡发软化，取约5 g 样品进行匀浆。

8.1.2 即食海参：取约5 g 样品进行匀浆。

8.1.3 粉末及液体样品：可直接进行DNA 提取。

8.2 样品DNA 提取

8.2.1 DNA 提取方法

宜采用商品化的动物组织DNA 提取试剂盒进行DNA 提取，具体提取步骤参照试剂盒说明书。

也可采取8.2.2 的CTAB 法进行提取。

3

8.2.2 CTAB 法提取DNA

8.2.2.1 称取约200 mg 已经制备好的样品于2 mL 离心管中，加入1.0 mL 2.0% CTAB 裂解液和10 μL

蛋白酶K，振荡混匀，65 ℃恒温30 min，期间每隔10 min 振荡混匀。

8.2.2.2 15 000 g 离心10 min，取上清液至一新的离心管，加入300 μL 三氯甲烷，涡旋振荡充分混

匀，15 000 g 离心10 min。

8.2.2.3 取上清液至新的离心管中，加入2 倍体积的0.5% CTAB 沉淀液，颠倒混匀，室温静置1 h，

15 000 g 离心5 min，弃上清液。

8.2.2.4 加入400 μL 1.2 mol/L NaCl 溶液，室温放置10 min，使DNA 全部溶解，加入10 μL RNase

A 酶，37 ℃恒温20 min。

8.2.2.5 加入400 μL 三氯甲烷，涡旋振荡混匀，15 000 g 离心10 min，取上清液至新的离心管，加

入0.7 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，15 000 g 离心10 min。

8.2.2.6 弃上清液，加入500 μL 70% 乙醇，颠倒混匀，15 000 g 离心2 min，弃上清液。重复一次。

8.2.2.7 短暂离心，将残余上清液吸尽，将DNA 晾干。加入20 μL ～ 100 μL TE 溶液(酌情加入，

使DNA 的浓度满足后续检测的需求)，使DNA 完全溶解。DNA 样品保存于-20 ℃备用。

8.3 DNA 浓度和纯度的测定

样品DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260 nm 和280 nm 处的吸光值A260 和

A280。DNA 的浓度按公式(1)进行计算：

c = A × N × 50 … …………………………………………………(1)

式中：

c —— DNA 浓度，单位为纳克每微升(ng/μL);

A —— 260 nm 处的吸光值;

N ——核酸稀释倍数。

当DNA 浓度在5 ng/μL~60 ng/μL 之间，A260/A280 比值在1.6 ～ 2.1 之间时，DNA 模板适宜于PCR 扩增。

8.4 实时荧光PCR 检测

8.4.1 实时荧光PCR 反应体系

反应体系体积为20 μL，其中含：实时荧光PCR 反应混合液10 μL，上游引物和下游引物

(10 μmol/L)各0.4 μL，探针(10 μmol/L)0. 4 μL，模板DNA(5 ng/μL~60 ng/μL)2 μL，双蒸水补足

至20 μL。

8.4.2 实时荧光PCR 反应参数

实时荧光PCR 反应条件一般为：95 ℃ 2 min ;95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s ，40 个循环。根据所用仪器

型号及试剂不同，按使用说明进行适当调整。

8.5 质量控制

8.5.1 空白对照：无FAM 荧光扩增曲线，无Ct 值。

8.5.2 阴性对照：无FAM 荧光扩增曲线，无Ct 值。

8.5.3 阳性对照：FAM 荧光通道出现典型的扩增曲线，Ct 值≤ 30.0。

以上条件有一条不满足时，试验视为无效。

9 结果判定及表述

9.1 双孔复检的Ct 值皆> 37.0 或无Ct 值，可判为阴性，表明样品中不含有暗色刺参DNA，表述为

4

“未检出暗色刺参成分”。

9.2 双孔复检的Ct 值皆≤ 37.0，且荧光通道出现典型的扩增曲线，可判为阳性，表明样品中含有暗

色刺参DNA, 表述为“检出暗色刺参成分”。

9.3 双孔复检，其中一个Ct 值> 37.0，另一个Ct 值≤ 37.0，则需要再进行一次单孔试验，若Ct 值>

37.0，则表述为“未检出暗色刺参成分”;若Ct 值≤ 37.0，表述为“检出暗色刺参成分”。

5

附 录 A

(规范性)

试剂配制

A.1　氢氧化钠溶液(10 mol/L)

在160 mL 双蒸水中加入 80.0 g 氢氧化钠(NaOH)，溶解后冷却至室温，再加双蒸水定容至200 mL。

A.2　Na2-EDTA 溶液(0.5 mol/L，pH 8.0)

称取18.61 g Na2-EDTA，加入70 mL 双蒸水中，再加入适量A.1 配制的氢氧化钠溶液，加热至

完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(A.1)调pH 至8.0，加双蒸水定容至100 mL，在103.4

kPa 和121 ℃条件下灭菌20 min。

A.3　Tris-HCl 溶液(1 mol/L，pH 8.0)

称取121.14 g Tris 溶解于800 mL 双蒸水中，用HCl 调pH 至8.0，加双蒸水定容至1 000 mL，在

103.4 kPa 和121 ℃条件下灭菌20 min。

A.4　CTAB 裂解液(2.0%)

称取4.0 g CTAB，16.36 g NaCl， 加入20 mL 1 mol/L Tris-HCl 溶液(pH 8.0)，8 mL 500 mmol/L

Na2-EDTA 溶液(pH 8.0)，先用70 mL 双蒸水溶解，再定容至200 mL，在103.4 kPa 和121 ℃条件下

灭菌20 min。

A.5　CTAB 沉淀液(0.5%)

称取1.0 g CTAB，0.47 g NaCl，先用70 mL 双蒸水溶解，再定容至200 mL，在103.4 kPa 和121 ℃

条件下灭菌20 min。

A.6　蛋白酶K 溶液(20 mg/mL)

将200 mg 的蛋白酶K 加入到9.5 mL 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K 完全溶解，加水定容到10 mL，

分装成小份贮存于-20 ℃。

A.7　NaCl 溶液(1.2 mol/L)

称取14.03 g NaCl，先用70 mL 双蒸水溶解，再定容至200 mL，在103.4 kPa 和121 ℃条件下灭

菌20 min。

A.8　TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;1 mmol/L Na2-EDTA 缓冲液，pH 8.0)

取5 mL 1 mol/L，pH 8.0 的Tris-HCl 溶液和1 mL 0.5 mol/L，pH 8.0 的Na2-EDTA 溶液，加入到

400 mL 双蒸水中，再定容至500 mL，在103.4 kPa 和121 ℃条件下灭菌20 min。

A.9　实时荧光PCR 反应混合液

10 μL 反应体系包括：1 U ～ 2 U 的Taq 酶、1×PCR 缓冲液、2.5 mmol/L～ 4.0 mmol/L的Mg2+、0.2 mmol/L

的d(A、C、G)TPs、0.2 mmol/L～0.4 mmol/L dUTP、400 mmol/L ROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。

6

附 录 B

(资料性)

扩增的靶标参考序列

CAGCTGGAGGAGGAGACCCTATTTTATTCCAACACCTCTTTTGATTTTTTGGTCATCCGGAAGTTTATATT

CTAAT TCTTCCTGGGTTTGGAATGA TTTCTCACGTAATTGCCCATTATAGAGGTAAGCAAGAACCCTTTG

GTTACCTAGGAATGGTTTATGCTATGGTAGCCATAGGAATCCTAGGATTCCTAGTCTGAGCCC(下划线表

示引物，方框表示探针)