T/SPMA 010-2023 疟原虫核酸检测 多重PCR法

《T/SPMA 010-2023 疟原虫核酸检测多重PCR法》团体标准的主要内容可以总结如下：

​​1. 标准的目的与背景：​​

• ​​目标：​​ 规范人体血液样本中疟原虫核酸的检测方法，使用多重PCR技术提高检测效率。
• ​​背景：​​ 中国已消除疟疾，当前病例均为境外输入。高效、准确地发现和诊断输入性疟疾病例对于维持消除状态和常态化防控至关重要。
• ​​需求：​​ 现有检测方法多为单基因检测，效率不高。本标准借鉴国际经验，制定两种多重PCR方法，可同时检测多个目标基因（5个）。

​​2. 适用范围：​​

• 适用于人体血液样本（静脉血或末梢血）中疟原虫的核酸检测。

​​3. 核心方法：​​
标准规定了两种检测方法：
* ​​A. 多重PCR法（常规电泳检测）：​​
* ​​原理：​​ 使用嵌合引物技术（见附录A）。设计5对引物（1对疟原虫属特异 + 4对种特异：恶性、间日、三日、卵形），在同一反应管中进行PCR扩增。
* ​​引物设计：​​ 引物5'端为21bp通用序列，3'端为特异性序列（见附录B.1）。
* ​​反应体系：​​ 使用预混液（2X Multiplex PCR Master Mix）和特定的引物混合液（见附录B.2, B.3）。
* ​​扩增程序：​​ 采用“三温”循环（58°C, 62°C, 68°C）以提高特异性和灵敏度（见附录B.5）。
* ​​检测：​​ PCR产物通过含染料的2%琼脂糖凝胶电泳分离（见附录B.6, D）。
* ​​结果判读：​​
* ​​有效性：​​ 阴性/空白对照无条带；混合阳性对照出现5条带（属特异334bp + 4个种特异：恶性256bp, 卵形400bp, 三日582bp, 间日778bp）。
* ​​样本结果：​​ 阴性样本无条带；阳性样本通常显示属特异条带和至少1个种特异条带。根据条带大小和数量判断感染虫种（单种或混合感染）。仅出现属特异条带需测序确认（可能密度低或其他虫种）（见附录B.7, B.8）。
* ​​灵敏度：​​ 种特异性平均~4.85虫/μL血，属特异性平均0.41虫/μL血（见附录A）。

*   **B. 多重荧光PCR法（实时荧光检测）：**
    *   **原理：** 基于TaqMan探针技术。设计5套引物探针（1套属特异 + 4套种特异），分装在两个反应管（A管：恶性、间日、属；B管：三日、卵形）中进行实时荧光PCR（见附录C.1, A）。
    *   **探针标记：** 属特异用CY5；恶性疟用JOE；间日疟用FAM；三日疟用FAM；卵形疟用JOE。
    *   **反应体系：** 使用核心组分（5X buffer, MgCl2, dNTPs, UNG酶, Taq酶）分别配制A管和B管反应液（见附录C.2, C.3）。
    *   **扩增程序：** 包括UNG处理（防污染）、预变性、40-45个循环的变性/退火延伸（55°C时采集荧光信号）（见附录C.4）。
    *   **检测：** 仪器实时监测各通道（FAM, JOE/HEX/VIC, CY5）的荧光信号，记录Ct值。
    *   **结果判读：**
        *   **有效性：** 阳性对照Ct ≤30；阴性对照Ct >39或无Ct值/曲线。
        *   **样本结果：** Ct值 ≤39且有典型S型扩增曲线判为阳性。根据Ct值出现的通道判定感染虫种（见附录C.6, C.7）。
    *   **灵敏度：** 约1虫/μL血（见附录A）。

​​4. 关键要素：​​

• ​​仪器设备：​​ 详细列出了所需的PCR仪（普通和荧光）、电泳设备、成像系统、生物安全柜、冰箱、离心机、移液器等及其规格要求（见第4章）。
• ​​试剂与材料：​​ 规定了试剂纯度（分析纯）、用水标准（GB/T 6682三级水）、核酸提取试剂盒、PCR核心组分（预混液或buffer/MgCl2/dNTPs/酶）、特异性引物探针（序列见附录B.1, C.1）、质控品（阳性和阴性对照）、电泳试剂配方（见附录D）以及耗材要求（包括滤芯吸头）（见第5章）。
• ​​样本要求：​​
  • ​​类型：​​ 静脉血（抗凝管）或末梢血（滤纸片）。
  • ​​采集与保存：​​ 明确采集方式、标记、运输（生物安全箱加冰）、保存条件（短期-20°C±5°C≤3月；长期-70°C；避免反复冻融）（见附录E.1, E.2）。
  • ​​DNA提取：​​ 使用有质量保证的全血DNA提取试剂盒，按说明书操作。推荐100μL血提取100μL DNA。滤纸血样需用PBS洗脱（见附录E.3）。
• ​​生物安全与污染控制：​​
  • 操作全程需符合GB 19489实验室生物安全要求。
  • 强调分区操作（试剂准备区、样本处理区、核酸扩增区、扩增产物分析区）。
  • 废弃物（除PCR产物外）必须高压灭菌（103.4 kPa, 20 min）。
  • 防污染措施严格遵循WS/T 230（使用滤芯吸头、UNG酶处理、设置空白对照、规范操作等）（见第7章、附录E.4）。
• ​​质量控制：​​
  • 每次检测必须设置​​阳性对照​​（含疟原虫DNA/质粒）、​​阴性对照​​（健康人DNA）和/或​​空白对照​​（无模板）。
  • 详细规定了两种方法的结果有效性判定标准（见B.7.1, C.6.1）。
• ​​规范性附录：​​
  • ​​附录A (资料性)：​​ 详细解释了两种多重PCR方法的技术原理和性能参数（灵敏度、特异性）。
  • ​​附录B (规范性)：​​ 详细规定了常规多重PCR法的具体操作步骤、引物序列、反应体系、程序、电泳分析和结果判读（含标准序列）。
  • ​​附录C (规范性)：​​ 详细规定了多重荧光PCR法的具体操作步骤、引物探针序列、反应体系（A/B管）配制、程序、仪器设置、结果分析和判读（含标准序列）。
  • ​​附录D (规范性)：​​ 规定了电泳相关试剂的配制方法（加样缓冲液、琼脂糖凝胶、TAE缓冲液）。
  • ​​附录E (规范性)：​​ 规定了样本的采集、运输、保存、DNA提取方法和生物安全要求。
• ​​专利声明：​​
  • 明确指出附录B和C中涉及的关键技术（引物设计、反应体系配制、参数设置）可能涉及上海市疾病预防控制中心和深圳生科原生物有限公司的专利。
  • 声明专利持有人愿意在合理无歧视条件下进行授权许可谈判。使用者需自行注意潜在的专利问题（见前言）。

​​5. 核心价值：​​

• ​​高效率：​​ 可同时检测疟原虫属和四种主要致病虫种（恶性、间日、三日、卵形），显著提升检测通量。
• ​​高灵敏度与特异性：​​ 两种方法均具有较高的灵敏度和特异性，能满足输入性疟疾监测和临床诊断的需求。
• ​​标准化：​​ 为疟原虫核酸检测提供了详细、规范的操作流程和质量控制要求，确保不同实验室结果的可比性和可靠性。
• ​​实用性：​​ 提供了两种可选方法（电泳法成本较低，荧光法通量高/闭管防污染），适应不同实验室条件。
• ​​前瞻性：​​ 关注消除疟疾后输入性病例精准防控的关键需求。

这份标准是维持中国消除疟疾状态、提升输入性疟疾监测和诊断能力的重要技术支撑文件。