T∕CAV 022-2025 人副流感病毒核酸检测技术指南

以下是《人副流感病毒核酸检测技术指南》（T/CAV 022-2025）的详细内容总结：

​​一、文件基本信息​​

• ​​标准号​​：T/CAV 022-2025
• ​​名称​​：人副流感病毒核酸检测技术指南
• ​​发布日期与实施日期​​：2025年4月23日
• ​​归口单位​​：中国疫苗行业协会
• ​​起草单位​​：中国疾控中心病毒病所、医疗机构及生物科技公司等共9家单位。
• ​​目的​​：规范人副流感病毒（HPIV）核酸检测流程，提升监测数据质量，支持疾病防控。

​​二、核心内容​​

​​1. 适用范围​​

• 适用于​​人呼吸道标本​​（鼻拭子、咽拭子、肺泡灌洗液等）中HPIV的核酸检测。

​​2. 术语定义​​

• ​​人副流感病毒（HPIV）​​：单股负链RNA病毒，分4种血清型（HPIV1-4），其中HPIV1/3属呼吸道病毒属，HPIV2/4属腮腺炎病毒属。

​​3. 检测流程​​

​​(1) 标本处理与保存​​

• ​​普通呼吸道标本​​：无需预处理，直接提取RNA。
• ​​痰液标本​​：需用​​蛋白酶K​​或​​痰液消化液​​（附录A）在55℃下消化30-60分钟。
• ​​保存条件​​：
  • 24小时内检测：2-8℃冷藏；
  • 长期保存：-60℃至-80℃超低温（避免反复冻融）。

​​(2) 核酸提取​​

• 按试剂盒或全自动提取仪操作，提取后RNA短期存于2-8℃，长期存于-60℃至-80℃。

​​(3) 引物与探针设计​​

• 针对4种血清型设计特异性引物和探针（附录B.1），探针标记不同荧光基团：
  • HPIV1：FAM-BHQ1
  • HPIV2：VIC-BHQ1
  • HPIV3：CY5-BHQ3
  • HPIV4：Texas Red-BHQ2

​​(4) 实时荧光RT-PCR反应​​

• ​​反应体系​​（25μL，附录B.2）：
  • 预混缓冲液、逆转录酶、血清型特异性引物（400nM）、探针（200nM）、RNA模板等。
  • 商品化试剂盒可参照说明书。
• ​​反应条件​​：
  • 反转录：45℃、5分钟；
  • 预变性：95℃、5分钟；
  • 扩增循环（40次）：95℃ 15秒 → 57℃ 34秒（退火延伸时收集荧光）。

​​(5) 结果判定​​

• ​​阳性​​：Ct值＜35.0，S型扩增曲线；
• ​​阴性​​：Ct值＞38.0或无扩增；
• ​​可疑​​（35.0≤Ct≤38.0）：需复检，复检后Ct≤38.0且起峰判为阳性。

​​三、质量控制​​

1. ​​对照设置​​：
   • 阴性对照（无Ct/无曲线）、阳性对照（Ct＜35且有S曲线）、提取对照（无Ct）、RNase P对照（监测标本质量）。
   • ​​注​​：HPIV阴性时，若RNase P阴性表明标本质量不合格。
2. ​​仪器维护​​：定期校准PCR仪、核酸提取仪、移液器等。
3. ​​防污染措施​​：实验场所定期消毒与验证。

​​四、结果报告要求​​

报告需包含：

• ​​标本信息​​：编号、类型、来源、状态；
• ​​检测信息​​：方法、试剂、操作流程、结果、质控数据；
• ​​实验室信息​​：设备编号、校准日期；
• ​​审核信息​​：人员、日期、结果。

​​五、生物安全​​

1. ​​实验室等级​​：在​​生物安全二级（BSL-2）​​ 实验室操作（依据《人间传染的病原微生物目录》2023版）。
2. ​​规范依据​​：遵守GB 19489和WS 233的安全要求。
3. ​​废弃物处理​​：按GB 19489规定执行。

​​六、附录内容​​

• ​​附录A（痰液预处理）​​：
  • 蛋白酶K法：加等体积2mg/mL蛋白酶K，55℃消化30-60分钟。
  • 消化液法：含二硫苏糖醇、盐类等（详见表A.1）。
• ​​附录B（引物与体系）​​：
  • ​​表B.1​​：4种HPIV血清型的引物/探针序列（如HPIV1上游引物：GCAATATATGCGTATTCATCAAAC）。
  • ​​表B.2​​：RT-PCR反应体系组成（如预混缓冲液12.5μL、引物各1.0μL等）。

​​七、制定背景​​

• HPIV是儿童呼吸道感染的重要病原体，疾病负担仅次于流感、新冠和呼吸道合胞病毒。
• 实时荧光RT-PCR因高灵敏度和特异性，被列为HPIV检测的金标准。

​​总结​​：该指南系统规范了HPIV核酸检测的全流程，涵盖标本处理、核酸提取、试剂设计、检测方法、结果判读及质控要求，为实验室提供标准化操作依据，助力HPIV感染的精准防控。