ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 244—2025
口蹄疫O 型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼
吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析
检测方法
Colloidal gold immunochromatographic assay for detection of antibodies
against FMDV type O、ASFV、CSFV、PRRSV
2025 - 5 - 19 发布2025 - 5 - 19 实施
中国兽医协会 发布
T/CVMA 244—2025
I
前言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本标准涉及专利。
本标准由兰州兽研生物科技有限公司提出。
本标准由中国兽医协会归口。
本标准起草单位：兰州兽研生物科技有限公司、中国农业科学院兰州兽医研究所、青海省动物疫病
预防控制中心、河北省动物疫病预防控制中心、隆回县动物疫病预防控制中心。
本标准主要起草人：蒋韬、林密、孙燕燕、闫丽欢、张海霞、李昕、杨光、贺华丽、李涛善、包艳
芳、郭建宏、何继军、杨吉飞、张立成、王谢忠、李翀、魏泽华、张腾帅、周早花。
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II
引 言
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到条目5、7、8、9、10、11、附录A
和附录B 相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。
该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件
下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以
下联系方式获得：
专利持有人姓名：兰州兽研生物科技有限公司
地址：甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1 号
请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责
任。
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1
口蹄疫O 型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检
胶体金免疫层析检测方法
1 范围
本文件描述了口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析检
测方法。
本文件适用于猪血清中口蹄疫病毒O型抗体、非洲猪瘟病毒抗体、猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综
合征病毒抗体快速检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
胶体金免疫层析技术 Colloidal gold immunochromatography assay;GICA
以胶体金作为示踪物，将抗原抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析来呈现免疫反应结果的一种免
疫标记技术。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ASFV：非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus)
CSFV：猪瘟病毒(Swine fever virus)
FMDV：口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus)
PEG 6000：聚乙二醇6000(Polyethylene Glycol 6000)
PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)
SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Ddodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
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5 技术原理
采用胶体金免疫层析技术，检测口蹄疫O型病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征
病毒抗体。通过样本与免疫胶体金标记物沿层析膜移动，样本中目标抗体分别与四种免疫胶体金标记物、
检测线(T线)上的抗原结合而显色，免疫胶体金标记物继续移动与质控线(C线)上的抗体结合显色。
若某病毒对应的观测窗里的C线与T线均显色，则该待测样本含有对应病毒抗体;若某病毒对应的观测
窗里的C线显色且T线不显色，则该待测样本不含有对应病毒抗体。
6 试剂与耗材
6.1 口蹄疫O 型病毒纯化抗原146S，见附录A 的A.1。
6.2 非洲猪瘟病毒重组p30 蛋白，见A.2。
6.3 猪瘟病毒重组E2 蛋白，见A.3。
6.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒N 蛋白，见A.4。
6.5 口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析试纸条，见附录B。
6.6 相关试剂配制，见附录C。
7 器材
7.1 三维划膜喷金仪。
7.2 数控高速斩切机。
7.3 隔水式恒温培养箱。
7.4 磁力搅拌器。
7.5 可调单道移液器(10 μL ~ 100 μL、100 μL ~ 1000 μL)。
8 样品采集及保存
8.1 样品采集
按照NY/T 541规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于2 mL，用自然析出法分
离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。
8.2 血清样品的保存与运输
按照NY/T 541 规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存。若超过一周
检测，置于- 20 ℃以下冷冻保存。
9 操作步骤
9.1 取检测卡
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将试剂盒从2 ℃ ~ 8 ℃取出，平衡10 min，拆除铝箔袋，将试纸卡平放在桌面上。
9.2 加样及孵育
用移液器吸取血清样本，向各样品孔中加入30 μL，之后再分别向样品孔中各滴加30 μL 扩展液。
结果将在10 min 内出现在观测框。
10 试验成立条件
试纸卡 C 线显色，试验成立，结果有效;C 线不显色，试验不成立，结果无效。
11 结果判定
观察各观测窗内T 线色带有无，按照如下标准分别进行判定。被检血清样品C 线与T 线均出现清
晰可见红色条带，判定为阳性;被检血清样品仅C 线出现清晰可见红色条带，T 线不显色，判定为阴性。
如图1。
图 1 本联检试纸卡各观测窗检测结果示意图
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附 录 A
(资料性)
抗原制备
A.1 口蹄疫O型病毒纯化抗原146S制备
A.1.1 毒种的繁殖与灭活
将O/MYA98/JSCJ/2010 细胞毒种，按维持液5% ~ 10 %的量接种至生长良好的BHK-21 单层细胞，
于37 ℃培养8 h ~ 12 h。当达到90 %以上细胞病变时，用7.5% NaHCO3 溶液调pH 至7.6 ~ 7.8，加入
青霉素(100 IU/mL)、链霉素(100 IU/mL)，用2 mmol/L 二乙烯亚胺在30℃下灭活24 h，加入2%
硫代硫酸钠阻断。2 ℃ ~ 8 ℃ 4000 r/min 离心30 min，取上清即为O/MYA98/JSCJ/2010 灭活制苗病毒抗
原液。-20 ℃冻存。
A.1.2 抗原的去脂与浓缩
将-20 ℃保存的O/MYA98/JSCJ/2010 制苗灭活病毒抗原解冻，按80 g/L 加入PEG 6000 和40 g/L 加
入NaCl，充分搅拌4 h，2 ℃ ~ 8 ℃过夜;后8000 r/min 离心45 min，弃上清;用PB 缓冲液悬浮沉淀
(冰上操作)，匀浆器反复研磨，至终体积100 mL;加入2 倍体积的三氯乙烯于密闭容器中，剧烈振
荡充分乳化，后在2 ℃ ~ 8 ℃ 8000 r/min 离心30 min，收集上层液;继续2 ℃ ~ 8 ℃、45000 r/min 离心
3 h，弃上清;PB 缓冲液悬浮沉淀，匀浆器中研磨，至终体积6 mL;加入1 %的脱氧胆酸钠溶液，充分
摇匀，2 ℃ ~ 8 ℃过夜，即为浓缩病毒抗原。
A.1.3 蔗糖密度梯度离心
配制45 %、35 %、25 %、15 %四种浓度梯度蔗糖溶液;在离心管中先加入45 %蔗糖溶液2.5 mL，
再依次叠加35 %、25 %、15 %蔗糖溶液2.5 mL，制备6 个蔗糖梯度柱，2 ℃ ~ 8 ℃静置过夜;次日将
浓缩病毒抗原液分别加入6 个蔗糖梯度柱顶部(每个柱子加入1 mL)，2 ℃ ~ 8 ℃、35000 r/min 离心
2.5 h。
A.1.4 抗原146S 收集
离心结束后，取1 管自上而下吸取梯度离心抗原，每0.5 mL 作为1 个收集级分，对收集的级分进
行顺序编号，共收集22 个级分。其余5 管重复上述操作。用紫外分光光度计测定22 个级分OD259nm 值，
将OD259nm 大于0.4 的级分合并，作为口蹄疫O 型病毒纯化抗原146S。
A.2 非洲猪瘟病毒重组p30 蛋白制备
将实验室保存的pET-28a-p30 重组阳性质粒转化至Rosetta 感受态细胞中，挑取单克隆后进行测序;
将测序正确的菌液1﹕100 加入到2×YT 培养基扩大培养至OD600nm 为0.6 ~ 0.8 后，加入终浓度为0.1
mmol/L 的IPTG 在37℃诱导表达4 h，12000 r/min 离心10 min 后收集沉淀;PBS 重悬沉淀后反复冻融
3 次，超声破碎至液体清亮(超声条件：电压200 V，工作3 s，暂停3 s);12000 r/min 离心10 min，
分别收集沉淀和上清，SDS-PAGE 分析蛋白的表达情况。将沉淀使用8 mol/L 的尿素裂解后复性，使用
Ni 柱法进行纯化(用终浓度为20 mmol/L 和50 mmol/L 的咪唑洗脱杂蛋白3 次，每次10 mL，后使用
200 mmol/L 的咪唑洗脱目的蛋白)。
A.3 猪瘟病毒重组E2 蛋白制备
A.3.1 载体构建
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以猪瘟病毒C 株(GenBank：AF531433)E2 基因为表达目的基因的参考序列，合成昆虫细胞密码
子优化的基因，将目的片段克隆到pFastbac 启动子骨架上，连接His，便于纯化。
A.3.2 转化杆粒
采用 42 ℃水浴热激90 s 的方法转化DH10Bac 感受态细胞，加入1 ml 无抗LB 摇菌4 h ~ 5 h。
A.3.3 菌落鉴定
取 50 μL 复苏后的菌液均匀地涂抹到LB 平板(50 μg/mL Kan，7 μg/mL Gentamicin，7 μg/mL
Tetracycline，40 μg/mL X-gal，40 μg/mL IPTG)上，倒置于37 ℃的恒温培养箱培养48 h 至蓝白分明。
挑3 个白色的克隆，重新划线在LB 平板(50 μg/mL Kan，7 μg/mL Gentamicin，7 μg/mL Tetracycline，
40 μg/mL X-gal，40 μg/mL IPTG)上，37 ℃过夜培养。用PCR 方法进行鉴定，引物为M13F：
5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'，M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，目的片段长度为3500 bp。
A.3.4 Bacmid 提取
用质粒提取试剂盒提取含有目的基因的Bacmid。
A.3.5 转染昆虫细胞
将 Bacmid 转入昆虫细胞sf 9，置于28 ℃恒温培养箱中，培养4 d ~ 5 d。待细胞明显膨大、细胞中
出现黑色小颗粒、细胞生长明显受到抑制等现象出现，收集上清，即为第一代含有目的基因的重组杆状
病毒P1。将病毒液在Sf 9 细胞上传3 代后，以1 %的比例感染Sf9 细胞。28 ℃培养96 h 后，收集培养
上清。
A.3.6 蛋白纯化
将收集的培养上清12000 r/min 离心10 min，收集上清，用离心超滤法浓缩。浓缩的上清在镍离子
亲和层析洗液(50 mmol/L 磷酸钠、300 mmol/L 氯化钠，pH 7.0)中4 ℃透析过夜。平衡过的上清加入
镍离子亲和层析柱，4 ℃吸附30 min 后，用40 mmol/L 咪唑洗脱，收集洗脱液。用SDS-PAGE 电泳检
测纯化效果。
A.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白制备
以PRRSV CH-1R 毒株结构蛋白N 的基因序列(GenBank 号：AAC15449.2)为参考，在N 基因序
列(372 bp)5′端添加His 和S 标签序列，并对原核表达密码子进行优化，委托基因合成公司合成重组
表达质粒pET28a-PRRSV-N。经BamHⅠ+NotⅠ双酶切鉴定并进行测序验证。按质粒转化步骤在冰上将重
组质粒pET28a-PRRSV-N 转化至BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50 mg/L 卡那霉素的固体LB 培
养基上，37 ℃培养12 h，挑取阳性单克隆菌落接种于含50 mg/L 卡那霉素的液体LB 培养基中，37 ℃、
220 r/min 培养2 h ~ 4 h，当菌液OD600nm 值达到0.6 ~ 0.8 时，加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 诱导目
的蛋白表达。4500 r/min 离心30 min 收集菌体。PB 缓冲液重悬菌体，冰浴超声，高速离心分离上清和
沉淀，用等体积的8 mol/L 尿素溶解沉淀，SDS-PAGE 鉴定分析。
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附 录 B
(资料性)
口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析试纸条制备
B.1 口蹄疫O型病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备
B.1.1 胶体金溶液制备
取1 %氯金酸水溶液1 mL 加蒸馏水至100 mL 制成0.01 %氯金酸水溶液，加热至沸腾，加入不同
1.5 mL 1 %(w/v)柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直至液体变为酒红色，冷却备用。
B.1.2 免疫胶体金(1)的制备
用0.02 mol/L K2CO3 溶液调节pH 至7.5，按1.1 μg/mL 最佳标记量加入口蹄疫O 型病毒纯化抗原
146 S，磁力搅拌40 min，加入100 g/L BSA 至终浓度为10 g/L，磁力搅拌30 min。10000 r/min 离心40
min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。
B.1.3 免疫胶体金(2)的制备
用0.02 mol/L K2CO3 溶液调节pH 至8.5，按4 μg/mL 最佳标记量加入兔抗IgG，磁力搅拌40 min，
加入100 g/L BSA 至终浓度为10 g/L，磁力搅拌30 min。10000 r/min 离心40 min，弃上清，将沉淀用金
胶缓冲液悬浮溶解，备用。
B.1.4 免疫胶体金玻璃纤维膜制备
将免疫胶体金(1)与(2)以8﹕2 混合，喷涂到长270 mm、宽10 mm 的玻璃纤维垫上，37 ℃干
燥30 min，得到金标垫。
B.1.5 含有C 线和T 线的硝酸纤维素膜的制备
将口蹄疫O 型病毒纯化抗原146 S 调整至0.2 mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2 mg/mL 的工作浓度，
分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成T 线与C 线，37 ℃干燥30 min，保存备用。
B.1.6 试纸的组装
在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大
于60 mm，宽不小于3.8 mm 的试纸，即制成口蹄疫O 型病毒抗体胶体金免疫层析试纸。
B.2 非洲猪瘟病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备
B.2.1 免疫胶体金(1)的制备
用0.02 mol/L K2CO3 溶液调节pH 至9.0，按2.7 μg/mL 最佳标记量加入非洲猪瘟病毒重组p30 蛋白，
磁力搅拌40 min，加入100 g/L BSA 至终浓度为10 g/L，磁力搅拌30 min。10000 r/min 离心40 min，
弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。
B.2.2 免疫胶体金(2)的制备
同B.1.3。
B.2.3 免疫胶体金玻璃纤维膜制备
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同B.1.4。
B.2.4 含有C 线和T 线的硝酸纤维素膜的制备
将非洲猪瘟病毒重组p30 蛋白调整至0.1 mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2 mg/mL 的工作浓度，分别
喷涂于硝酸纤维素膜上，形成T 线与C 线，37 ℃干燥30 min，保存备用。
B.2.5 试纸的组装
在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大
于60 mm，宽不小于3.8 mm 的试纸，即制成非洲猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸。
B.3 猪瘟病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备
B.3.1 免疫胶体金(1)的制备
用0.02 mol/L K2CO3 溶液调节pH 至7.5，按34 μg/mL 最佳标记量加入猪瘟病毒重组E2 蛋白，磁
力搅拌40 min，加入100 g/L BSA 至终浓度为10 g/L，磁力搅拌30 min。10000 r/min 离心40 min，弃
上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。
B.3.2 免疫胶体金(2)的制备
同B.1.3。
B.3.3 免疫胶体金玻璃纤维膜制备
同B.1.4。
B.3.4 含有C 线和T 线的硝酸纤维素膜的制备
将猪瘟病毒重组E2 蛋白调整至0.57 mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2 mg/mL 的工作浓度，分别喷涂
于硝酸纤维素膜上，形成T 线和C 线，37 ℃干燥30 min，保存备用。
B.3.5 试纸的组装
在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大
于60 mm，宽不小于3.8 mm 的试纸，即制成猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸。
B.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备
B.4.1 免疫胶体金(1)的制备
用0.02 mol/L K2CO3 溶液调节pH 至7.5，按4 μg/mL 最佳标记量加入猪繁殖与呼吸综合征病毒N
蛋白，磁力搅拌40 min，加入100 g/L BSA 至终浓度为10 g/L，磁力搅拌30 min。10000 r/min 离心40 min，
弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。
B.4.2 免疫胶体金(2)的制备
同B.1.3。
B.4.3 免疫胶体金玻璃纤维膜制备
同B.1.4。
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B.4.4 含有C 线和T 线的硝酸纤维素膜的制备
将猪繁殖与呼吸综合征病毒N 蛋白调整至0.42 mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2 mg/mL 的工作浓度，
分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成T 线和C 线，37℃干燥30 min，保存备用。
B.4.5 试纸的组装
在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大
于60 mm，宽不小于3.8 mm 的试纸，即制成猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金免疫层析试纸。
B.5 口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金试纸条的制备
将B.1 ~ B.4 制备的试纸条(如图2 所示)装入一个壳体中，再加干燥剂后密封单包装保存。
图 2 本联检试纸卡组装图
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附 录 C
(规范性)
试剂配制
C.1 PB 缓冲液
将表C.1 中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至600 mL，溶解，定容至1000 mL，调至pH 7.5，
置于2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。蒸馏水均应符合GB/T 6682 的要求。
表 C.1 PB 缓冲液配方
名称 用量
磷酸氢二钠15.49 g
磷酸二氢钠2.03 g
C.2 扩展液
将表C.2 中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至600 mL，溶解，定容至1000 mL，调至pH 7.4，
置于2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。蒸馏水均应符合GB/T 6682 的要求。
表 C.2 PB 缓冲液配方
名称 用量
磷酸氢二钠15.49 g
磷酸二氢钠2.03 g
吐温-20 0.1 mL
Proclin 300 0.5 mL
C.3 金胶缓冲液
将表C.3 中的试剂依次加入烧杯中，加PB 缓冲液至600 mL，溶解，定容至1000 mL，置于2 ℃ ~
8 ℃保存备用。蒸馏水均应符合GB/T 6682 的要求。
表 C.3 金胶缓冲液配方
名称 用量
吐温-20 2.5 mL
蔗糖 100.00 g
牛血清白蛋白50.00 g
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