NY/T 4498-2025 大葱品种鉴定 SSR分子标记法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
以下是对《NY/T 4498-2025 大葱品种鉴定 SSR分子标记法》标准的详细内容总结：
一、标准框架
- 范围
- 规定利用SSR标记进行大葱（Allium fistulosum var. giganteum）品种鉴定的方法，包括术语定义、操作流程、结果判定等。
- 适用于大葱品种DNA数据采集和鉴定。
- 规范性引用文件
- 包括GB/T 3543.2（种子扦样）、GB/T 6682（实验用水）、NY/T 2594（DNA分子标记总则）。
- 术语与定义
- 沿用NY/T 2594的术语，如SSR、等位变异等。
- 缩略语
- 列出APS、bp、CTAB、dNTPs、PAGE、TBE等关键术语缩写。
二、核心原理
- SSR标记原理：大葱基因组中SSR位点的重复次数存在品种间差异，通过PCR扩增特定SSR位点，结合电泳检测片段大小差异，实现品种区分。
三、关键操作流程
1. 样品准备
- 样品类型：种子、幼苗、叶片等（种子需按GB/T 3543.2扦样）。
- 样本量：每份样品≥30个个体，等量混合分析。
2. DNA提取（CTAB法）
- 步骤：
- 液氮研磨200mg样本，加入预热CTAB提取液（65℃水浴45~60min）。
- 三氯甲烷-异戊醇（24:1）抽提，离心取上清。
- 异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，TE缓冲液溶解。
- 质量控制：OD260/OD280比值需在1.7~2.0之间。
3. PCR扩增
- 反应体系（20μL）：
组分 终浓度 体积（μL） 10×缓冲液 1× 2.0 dNTPs 0.2 mmol/L 1.6 Taq酶 0.05 U/μL 0.2 正/反向引物 0.25 μmol/L 各1.0 DNA模板 2.5 ng/μL 2.0 双蒸水 - 12.2 - 反应程序：
- 94℃预变性5min → 35循环（94℃ 30s → 55℃ 30s → 72℃ 45s） → 72℃延伸10min → 4℃保存。
4. PCR产物检测
- 方法一：变性PAGE电泳
- 制胶：6%聚丙烯酰胺胶（含尿素），亲和硅烷/剥离硅烷处理玻板。
- 上样：PCR产物加6×上样缓冲液，95℃变性5min。
- 电泳：1800V恒压，时间依片段大小调整（如200bp约2.5h）。
- 银染：固定→染色→显影→定影，观察条带。
- 方法二：荧光毛细管电泳
- 多重检测：按附录F分组混合荧光标记引物产物（如FAM/HEX/ROX/TAMRA）。
- 变性：95℃ 5min，冰浴冷却。
- 上机：使用DNA分析仪（区分力1bp），配套软件分析片段大小。
5. 数据分析
- 等位变异记录：
- 纯合位点：X/X（如160/160）
- 杂合位点：X/Y（如160/165）
- 缺失：0/0
- 结果比对：逐一比对送检样品与对照样品的每个位点，统计差异位点数。
四、结果判定
- 判定规则：
- 不同品种：差异位点数 > 2
- 疑似相同：差异位点数 ≤ 2
- 结果表述：
"送检样品与对照样品采用[方法]检测，检测位点数[ ]，差异位点数[ ]，判定为[不同/疑同]。"
五、附录关键内容
附录A：仪器与试剂
- 仪器：PCR仪、电泳系统、离心机、分光光度计、DNA分析仪等。
- 试剂：CTAB、dNTPs、SSR引物、荧光染料（6-FAM/HEX/ROX/TAMRA）、银染试剂等。
附录B：溶液配制
- DNA提取液：CTAB提取液（含2% CTAB、1.4M NaCl）、TE缓冲液等。
- 电泳相关：6%变性PAGE胶、10×TBE、银染试剂（固定液、染色液等）。
附录C：引物信息
- 20对SSR引物：名称、染色体位置、正/反向序列（如P01:AFS015, Chr1）。
附录D：引物参数
- 关键参数：
引物 荧光标记 等位变异范围 (bp) 参照品种示例 P01 6-FAM 329–364 夏薇（329bp） P02 HEX 124–147 辽葱6号（124bp）
附录E：参照品种
- 21个品种：青杂2号、辽葱6号、春香等，含保藏编号（如国家种质库XIN25051）。
附录F：引物分组（荧光毛细管电泳）
- 分组示例：
组别 FAM标记 HEX标记 ROX标记 1 AFS088 AFS156, AFA15E08 AFB20G05, AFA16D05
六、注意事项
- 引物选择：普通引物用于PAGE，荧光标记引物用于毛细管电泳。
- 参照品种：必须与样品同步检测，校正系统误差。
- 特殊操作：
- PAGE银染时显影液需现加甲醛。
- 毛细管电泳前需预实验确定产物稀释倍数。
- 判定灵活性：若早期差异位点已>2，可提前终止检测。
总结
该标准体系完整覆盖大葱SSR鉴定的全流程，强调标准化操作（如CTAB-DNA提取、严格PCR体系）、双电泳方法互补，并通过参照品种和阈值判定确保结果可靠性。附录提供关键参数支撑实操，适用于种子质检、品种权保护等场景。
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