【超清版】 GB/T 44738-2024 饲用果胶酶活力的测定

ICS 65.120
CCS B 46
中华人民共和国国家标准
GB/T 44738—2024
饲用果胶酶活力的测定
Determination of feed pectinase activity
2024-10-26 发布2025-05-01 实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发 布

目　　次
前言 ····································································································· Ⅲ
1 范围 ·································································································· 1
2 规范性引用文件 ······················································································ 1
3 术语和定义 ··························································································· 1
4 原理 ·································································································· 1
5 试剂或材料 ··························································································· 1
6 仪器设备 ······························································································ 2
7 样品 ·································································································· 2
8 试验步骤 ······························································································ 2
8.1 试样溶液的制备 ················································································· 2
8.2 标准曲线绘制 ···················································································· 3
8.3 测定 ······························································································ 3
9 试验数据处理 ························································································· 3
10 精密度 ······························································································· 4

前　　言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）提出并归口。
本文件起草单位：武汉新华扬生物股份有限公司、北京昕大洋科技发展有限公司、广东溢多利生物
科技股份有限公司、山东隆科特酶制剂有限公司、诺维信（中国）投资有限公司。
本文件主要起草人：周樱、徐丽、詹志春、赵丽芳、冯国华、张法玲、孙薛蔚、苏丹、余艳、李阳源、
王克芬、王金凤。

1　范围
本文件描述了饲用果胶酶活力的分光光度测定方法。
本文件适用于饲料添加剂果胶酶和含有果胶酶的混合型饲料添加剂酶制剂中果胶酶活力的测定。
本文件不适用于碱性果胶酶活力的测定。
本方法定量限为10 U/g（或U/mL）。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
于本文件。
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 20195　动物饲料　试样的制备
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
果胶酶活力单位　pectinase activity unit
在37 ℃、pH 3.5 的条件下，每小时从质量浓度为2.25 mg/mL 的果胶溶液中分解释放1 mg 还原糖所
需要的酶量。
注：以U 表示。
4　原理
果胶酶水解果胶溶液产生还原糖，用3，5﹘二硝基水杨酸显色，以分光光度计比色测定，计算果胶
酶活力。
5　试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
5.1　水：GB/T 6682，三级。
5.2　氢氧化钠溶液（200 g/L）：称取氢氧化钠20.0 g，加水溶解，冷却至室温后定容至100 mL。
5.3　柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：称取一水柠檬酸21.01 g，加水溶解并定容至1 000 mL。
5.4　柠檬酸三钠溶液（0.1 mol/L）：称取二水合柠檬酸三钠29.41 g，加水溶解并定容至1 000 mL。
5.5　柠檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH=3.5）：取柠檬酸溶液（5.3）700 mL，柠檬酸三钠溶
液（5.4）300 mL，混匀，用柠檬酸溶液（5.3）或柠檬酸三钠溶液（5.4）调节pH 至3.5。
5.6　果胶溶液（3.0 mg/mL）：称取果胶（≥74% 聚半乳糖醛酸，CAS 号：9000﹘69﹘5）0.3 g，精确
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至0.001 g，加入80 mL 0.1 mol/L 柠檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液（5.5），搅拌并加热，直至果胶完全溶解，加
热时间不超过1 h，在搅拌加热的过程中可补加适量的柠檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液（5.5），总体积不超过
100 mL。继续搅拌至溶液冷却，用柠檬酸溶液（5.3）或柠檬酸三钠溶液（5.4）调节pH 至3.5，用柠檬
酸﹘柠檬酸钠缓冲液（5.5）定容至100 mL。临用现配。
5.7　3，5﹘二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取DNS 3.15 g，加水500 mL，搅拌并加热至45 ℃ 左右至完
全溶解。然后缓慢加入100 mL 氢氧化钠溶液（5.2），不断搅拌，直到溶液清澈透明（在加入氢氧化钠
过程中，保持溶液温度在45 ℃~48 ℃）。然后逐步加入91.0 g 四水合酒石酸钾钠，温度控制在45 ℃~
46 ℃，直到全部溶解。再加入2.5 g 苯酚和2.5 g 无水亚硫酸钠，溶液继续保持45 ℃~46 ℃ 并搅拌，直到
完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1 000 mL。过滤，取滤液，储存在棕色塑料瓶中，
避光保存，室温下存放7 d 后可使用，有效期为6 个月。
5.8　D﹘半乳糖醛酸标准溶液（10 mg/mL）：称取经65 ℃ 干燥4 h 的D﹘半乳糖醛酸（纯度≥97%，
CAS 号：91510﹘62﹘2）1 g，精确至0.001 g，加柠檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液（5.5）溶解，定容至100 mL。
临用现配。
5.9　D﹘半乳糖醛酸标准系列溶液：准确吸取适量的D﹘半乳糖醛酸标准溶液（5.8），用柠檬酸﹘柠檬酸
钠缓冲液（5.5）配制成质量浓度分别为0 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、
1.6 mg/mL 的系列标准溶液。临用现配。
6　仪器设备
6.1　分光光度计：波长精度1 nm，可在540 nm 比色。
6.2　分析天平：精度0.000 1 g。
6.3　pH 计：精度0.01。
6.4　涡旋混合器。
6.5　振荡器。
6.6　恒温水浴锅：精度0.1 ℃。
6.7　秒表。
6.8　磁力搅拌器。
6.9　离心机：转速不低于5 000 r/min。
7　样品
按照GB/T 20195 制备样品，至少200 g（或200 mL），固态样品应全部通过0.425 mm 孔径的分析
筛。充分混匀，密闭保存，备用。液态样品混匀后转移至样品容器中，密封保存，备用。
8　试验步骤
8.1　试样溶液的制备
8.1.1　固态试样溶液的制备
平行做2 份试验。称取样品0.2 g~1 g，精确至0.001 g，置于250 mL 锥形瓶中。准确加入50 mL 柠
檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液（5.5），若pH 偏离3.5，用柠檬酸溶液（5.3）或柠檬酸三钠溶液（5.4）调至
3.5，体积变化计入稀释倍数。置于振荡器或磁力搅拌器中匀速振荡或搅拌30 min，避免溶液溅出，静置
10 min，过滤或5 000 r/min 离心5 min，取滤液或上清液进行稀释，稀释后试样溶液中果胶酶活力控制在
1.29 U/mL~1.94 U/mL。
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8.1.2　液态试样溶液的制备
平行做2 份试验。准确移取样品0.2 mL~1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用柠檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液
（5.5）稀释、定容。若pH 偏离3.5，用柠檬酸溶液（5.3）或柠檬酸三钠溶液（5.4）调至3.5，体积变
化计入稀释倍数。稀释后试样溶液中果胶酶活力控制在1.29 U/mL~1.94 U/mL。
8.2　标准曲线绘制
分别吸取0.5 mL D﹘半乳糖醛酸标准系列溶液（5.9）和1.5 mL 柠檬酸﹘柠檬酸钠缓冲液（5.5），置
于25 mL 刻度试管中，涡旋3 s 混匀。加入2.5 mL DNS 试剂，混匀，沸水浴煮沸5 min。迅速冷却至室
温，加水定容至12.5 mL，涡旋3 s 混匀。以D﹘半乳糖醛酸溶液浓度为0 的反应液作为标准空白调零，
540 nm 处测定吸光度。以吸光度为横坐标、D﹘半乳糖醛酸溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线
性回归方程，R2 为0.99 以上。
8.3　测定
8.3.1　试验空白的测定
吸取1.5 mL 果胶溶液（5.6），置于25 mL 刻度试管中，放入37.0 ℃ ± 0.2 ℃ 水浴锅中预热5 min，
再加入2.5 mL DNS 试剂（5.7），涡旋3 s 混匀，于37.0 ℃ ± 0.2 ℃ 水浴锅中保温30 min。加入0.5 mL
已在37.0 ℃ ± 0.2 ℃ 预热的试样溶液（8.1），混匀，立即沸水浴煮沸5 min。迅速冷却至室温，加水定
容至12.5 mL，涡旋3 s 混匀，溶液全部倒入离心管，5 000 r/min 离心10 min，取上清液，以标准空白溶
液为空白对照，540 nm 波长处测定吸光度，记为试样空白吸光度A0。
8.3.2　试样的测定
吸取1.5 mL 果胶溶液（5.6），置于25 mL 刻度试管中，放入37.0 ℃ ± 0.2 ℃ 水浴锅中预热5 min，
再加入0.5 mL 已在37.0 ℃ ± 0.2 ℃ 预热的试样溶液（8.1），混匀，在37.0 ℃ ± 0.2 ℃ 水浴锅中精确反
应30 min。加入2.5 mL DNS 试剂（5.7），混匀，立即沸水浴煮沸5 min。迅速冷却至室温，加水定容
至12.5 mL，涡旋3 s 混匀，溶液全部倒入离心管，5 000 r/min 离心10 min，取上清液，以标准空白溶液
为空白对照，在540 nm 波长处测定吸光度，记为试样吸光度A。
9　试验数据处理
试样溶液中果胶酶活力以XD 表示，数值以果胶酶活力单位（简称酶活力单位）每毫升（U/mL）表
示，按公式（1）计算：
XD =
（?0）0:5
V t
…………………………（1）
式中：
 ─ 根据试样吸光度A由标准曲线计算的D ﹘ 半乳糖醛酸的质量浓度，单位为毫克每毫升
（mg/mL）；
0 ─ 根据试样空白吸光度A0由标准曲线计算的D﹘半乳糖醛酸的质量浓度，单位为毫克每毫升
（mg/mL）；
0.5 ─ 标准曲线制备中D﹘半乳糖醛酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；
V ─ 反应中酶液的体积，0.5 mL；
t ─ 反应时间，0.5 h。
XD 值应在1.29 U/mL~1.94 U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释倍数，再进
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行分析测定。
试样果胶酶活力以X 表示，数值以酶活力单位每克（U/g）或酶活力单位每毫升（U/mL）表示，
按公式（2）计算：
X =
XD 50
m
n …………………………（2）
式中：
50 ─ 试样溶液制备的提取体积，单位为毫升（mL）；
m ─ 试样的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）；
n ─ 试样的稀释倍数。
果胶酶活力以平行测定结果的算术平均值表示，保留至整数。
10　精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果绝对差值不超过其算术平均值的10%。
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