GB/T 27532-2024 犬瘟热诊断技术

ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国国家标准
GB/T27532—2024
代替GB/T27532—2011
犬瘟热诊断技术
Diagnostictechniquesforcaninedistemper
2024-11-28发布2025-06-01实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发布

目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
引言………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 缩略语…………………………………………………………………………………………………… 1
5 生物安全措施…………………………………………………………………………………………… 2
6 临床诊断………………………………………………………………………………………………… 2
7 样品采集、处理与保存…………………………………………………………………………………… 3
8 胶体金免疫层析法……………………………………………………………………………………… 4
9 病毒分离鉴定…………………………………………………………………………………………… 4
10 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)…………………………………………………………………… 5
11 免疫酶组织化学试验…………………………………………………………………………………… 7
12 RT-PCR………………………………………………………………………………………………… 8
13 荧光RT-PCR ………………………………………………………………………………………… 10
14 综合判定……………………………………………………………………………………………… 12
附录A (规范性) 试剂溶液的配制……………………………………………………………………… 13
附录B(资料性) RT-PCR、荧光RT-PCR引物和探针序列………………………………………… 15
附录C(资料性) 犬瘟热病毒RT-PCR反应产物电泳图……………………………………………… 16
附录D(资料性) 犬瘟热病毒荧光RT-PCR扩增曲线图……………………………………………… 17
Ⅰ
GB/T27532—2024

前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本 文件代替GB/T27532—2011《犬瘟热诊断技术》,与GB/T27532—2011相比,除结构调整和编
辑性改动外,主要技术变化如下:
———增加了缩略语(见第4章);
———增加了生物安全措施(见第5章);
———增加了流行病学(见6.1);
———增加了胶体金免疫层析法(见第8章);
———增加了荧光RT-PCR(见第13章);
———增加了综合判定(见第14章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。
本文件起草单位:青岛农业大学、青岛海华生物集团股份有限公司、逢时(青岛)海洋科技有限公司、
中国动物卫生与流行病学中心、河北北方学院、山东省农业科学院、青岛市城阳区农业农村服务中心、
青岛巴特菲科技发展有限公司、青岛市动物疫病预防控制中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中
心、重庆市动物疫病预防控制中心。
本文件主要起草人:单虎、张洪亮、刘刚、宋晓明、马清霞、王媛媛、李一飞、张瑞华、黄兵、肖颖、
杨瑞梅、黄娟、周芳、徐超、李彦、林佳旭、李明义、于永乐、秦志华、李健、李桂梅、段笑笑、邴啟政、刘丽蓉、
李然栋、王建琳、温建新、秦晓冰、马晶、杨珍。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
———2011年首次发布为GB/T27532—2011;
———本次为第一次修订。
Ⅲ
GB/T27532—2024
引 言
犬瘟热(caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus,CDV)引起的犬科、鼬科、
部分浣熊科和猫科动物的一种急性、高度接触性传染病,发病早期体温呈双相热型,随后以支气管炎、卡
他性肺炎、胃肠炎为特征,后期可见有神经症状如痉挛、抽搐等,部分病例可出现鼻部和脚垫高度角质
化、龟裂。犬科动物感染后病死率为30%~80%,雪貂的病死率可达100%。我国农业农村部将其列为
三类动物疫病。
犬瘟热病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus),是一种单链RNA
病毒,目前只有一种血清型。
犬瘟热病毒的宿主广泛,犬科(犬、狐、貉、狼等)、鼬科(水貂、雪貂、鼬等)、部分浣熊科(浣熊、白鼻熊
等)和猫科(虎、豹、狮)动物均易感,且幼龄动物比成年动物更易感,一般在断奶后2周~3周容易发病。
犬瘟热病毒会引起动物消化、呼吸和神经系统等多系统病症,病毒的来源、数量、毒力强弱和患病动
物免疫力不同,引起的临床症状不同。该病容易与上呼吸道感染、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染等疾
病相混淆,需要结合临床诊断和实验室检测进行确诊。
Ⅳ
GB/T27532—2024
犬瘟热诊断技术
1 范围
本文件描述了犬瘟热的临床诊断、胶体金免疫层析法、病毒分离鉴定、免疫过氧化物酶单层试验、免
疫酶组织化学、RT-PCR、荧光RT-PCR等方法。
本文件适用于犬瘟热的诊断和监测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHQ:黑洞淬灭剂(blackholequencher)
CD:犬瘟热(caninedistemper)
CDV:犬瘟热病毒(caninedistempervirus)
CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect)
Ct:循环阈值(cyclethreshold)
DAB:二氨基联苯胺(diaminobenzidine)
DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)
DMEM:dulbecco’s改良eagle培养基(dulbecco’smodifiedeaglemedium)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)
FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)
HRP:辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)
IPMA:免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidasemonolayerassay)
PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)
RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)
RT-PCR:反转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)
1
GB/T27532—2024
5 生物安全措施
进行样品采集、处理及保存等操作时按照NY/T541的规定执行。本文件中涉及的实验室生物安
全操作按照GB19489的规定执行。
6 临床诊断
6.1 流行病学
6.1.1 犬科、鼬科、部分浣熊科和猫科动物,如犬、狐、貉、狼、水貂、浣熊、虎、狮等动物均易感染CDV。
不同年龄、性别及品种的易感动物均可感染,断奶后2周~3周的幼龄动物最易感。
6.1.2 该病传染源主要为发病动物和隐性带毒动物。
6.1.3 CDV 主要通过呼吸道和消化道传播。发病动物和隐性带毒动物可通过鼻液、泪液、唾液、尿液以
及呼出的气体排出大量CDV。该病一年四季均可发生,以冬、春季多发。
6.2 临床症状
6.2.1 发病动物体温呈双相热型。
6.2.2 呼吸道型:主要表现为打喷嚏、咳嗽和呼吸困难;流清鼻涕至脓性鼻汁,眼角有脓性眼屎,伴有结
膜炎或角膜炎、角膜溃疡、浑浊等症状,甚至失明。
6.2.3 消化道型:主要表现为呕吐和腹泻;排便从干燥发展到腹泻,甚至出现水样便,严重时粪便中混
有血液,出现煤焦油状黑褐色血样便。
6.2.4 神经型:出现头、颈、四肢抽搐,步态不稳、站姿异常、共济失调等症状。
6.2.5 皮肤型:下腹部、大腿内侧可见米粒或豆粒大小的丘疹,随着病情发展水疱型丘疹转为化脓性丘
疹;伴有脚垫、鼻部角质化。
6.3 病理变化
6.3.1 剖检病理变化
6.3.1.1 肝脏肿大,质地变脆,表面有出血点及灰白色坏死灶;脾脏肿大坏死,质地变脆,有出血点,局部
淤血;肺脏有出血点,肺泡壁毛细血管淤血;肾脏肿大,质地变软,表面有出血点;消化道中胃肠黏膜有弥
漫性出血点,水肿并伴有糜烂或溃疡灶;心脏内膜有出血点。
6.3.1.2 中枢神经系统的病变包括脑膜充血,脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。
6.3.1.3 新生幼龄动物感染CDV 表现为胸腺萎缩。
6.3.2 组织病理变化
6.3.2.1 CDV 可在黏膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中形成嗜酸性包涵体,直
径1μm~5μm。
6.3.2.2 出现神经症状的动物可见神经元变性以及胶质细胞增生等。
6.4 结果判定
6.4.1 符合6.1中描述的2个及以上的流行病学特征,且出现6.2中2个及以上的临床症状,或可观察
到6.3中任一剖检病理变化或任一组织病理变化,可初步判为疑似CD。
6.4.2 疑似病例确诊应采集样品,按照第9章~第13章中的实验室方法进行检测。
2
GB/T27532—2024
7 样品采集、处理与保存
7.1 采样器材
组织研磨器、医用剪刀、解剖刀、穿刺针、医用注射器(2mL、5mL)及真空采血管、真空采血管(含
EDTA 抗凝剂)、无菌棉签拭子、样品保存管、离心管(1.5mL、10mL)、工作服、一次性手套、采样记录
单、记号笔、防水标签、自封袋、冰袋等。
7.2 试剂
7.2.1 0.01mol/LpH7.4PBS,按照附录A 中A.1配制。
7.2.2 青链霉素贮存液,按照A.2配制。
7.2.3 10%中性福尔马林固定液,按照A.3配制。
7.2.4 98%(体积分数)甲酸:避光密封保存。
7.3 样品采集与处理
7.3.1 血液样品
用一次性采血针采集全血或用含有EDTA 抗凝剂的真空采血管,在动物的前、后肢皮下静脉采血。
非抗凝血待凝固后分离血清,抗凝血可离心分离出血浆。用于CDV 的胶体金免疫层析法、RT-PCR、荧
光RT-PCR检测。
7.3.2 口眼鼻分泌物和粪便样品
用无菌棉签拭子取样,轻轻刮取双侧眼结膜分泌物;或蘸取鼻液、口咽分泌物;或在直肠末端旋转三
圈或取少量粪便样品。将上述拭子放入含有1mLPBS(其中每100mLPBS中加入0.2mL青链霉素
贮存液)的样品保存管中,搅拌片刻后,掰断拭子尾部,拧紧盖子。3000r/min离心20min后,取上清
液,待检。用于CDV 的胶体金免疫层析法、病毒分离鉴定、IPMA、RT-PCR、荧光RT-PCR检测。
7.3.3 组织样品
用无菌剪刀采集新鲜的肝、脾、肺等组织。立即进行固定,将组织切成约为2cm×2cm×1cm 大
小,置于10%中性福尔马林固定液中固定4d,然后置于新的10%中性福尔马林固定液中固定2d。将
上述组织块切成约为3mm~5mm 厚,置于98%甲酸中作用1h,用流动的自来水冲洗20min,最后置
于新的10%中性福尔马林固定液中固定3h。固定后,立即冷藏运输至实验室,用于CDV 的免疫组织
化学检测。
用无菌剪刀采集新鲜的肝、脾、肺等组织,取2g组织样品剪碎后加入10mLPBS(其中每100mL
PBS中加入0.2mL青链霉素贮存液)充分研磨,制成组织悬液。用腰椎穿刺法采集脑脊液,在动物背
部腰椎区域用穿刺针进行穿刺,当针头刺穿动物的蛛网膜下腔且出现落空感时,停止进针并连接医用注
射器,采集2mL~3mL动物脑脊液。将组织悬液和脑脊液,3000r/min离心20min后,取上清液,待
检。用于CDV 的病毒分离鉴定、IPMA、RT-PCR、荧光RT-PCR检测。
7.4 样品保存
采集的样品应保存于4℃条件下,用于病毒分离的样品应在48h内运至实验室。不能立即进行检
测的样品应保存于-20℃冰箱,长期保存应置于-70℃冰箱。
3
GB/T27532—2024
8 胶体金免疫层析法
8.1 器材与试剂
CDV 胶体金抗原检测卡。
8.2 样品处理
8.2.1 血液样品
将7.3.1中采集到的血清或血浆1滴~2滴(约20μL~40μL)与样品稀释液混合,置于样品保存管
中,待检。
8.2.2 口眼鼻分泌物和粪便样品
将7.3.2中采集到的棉签拭子放入样品稀释液中,振荡混匀,使样品充分溶解,静置10min使大颗
粒沉降到样品保存管底部,取上层液体,待检。
8.3 操作方法
8.3.1 用配套的滴管吸取3滴~4滴(约60μL~80μL)待检样品,缓慢滴加入样品孔中,当看到红色液
体在试纸条上移动时,放慢加样速度,整个加样过程控制在1min内完成。
8.3.2 加样完成后,将试纸条平放在桌面上,静置10min后,在20min内判读结果。
8.4 结果判定
8.4.1 对照线(C)显示红色,则试验成立,结果有效。
8.4.2 对照线(C)和检测线(T)均显色,判为疑似CDV 阳性,需要采用第9章~第13章中任何一项方
法进行确诊。
8.4.3 仅有对照线(C)显色,判为CDV 阴性。
9 病毒分离鉴定
9.1 器材
9.1.1 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)。
9.1.2 二氧化碳培养箱(37℃)。
9.1.3 Ⅱ级生物安全柜。
9.1.4 倒置显微镜。
9.1.5 电子天平:精度0.1mg。
9.1.6 微量可调移液器(100μL~1000μL、20μL~200μL、1μL~20μL)。
9.1.7 细胞培养瓶(25cm2 或75cm2 等)。
9.1.8 0.22μm 微孔滤器。
9.2 试剂
9.2.1 试验用水,符合GB/T6682的规定。
9.2.2 PBS,按照A.1配制。
9.2.3 DMEM 培养液,按照A.4配制。
4
GB/T27532—2024
9.2.4 新生牛血清。
9.2.5 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。
9.3 操作方法
9.3.1 细胞培养
在25cm2 细胞培养瓶中加入6mL含5%新生牛血清的DMEM 培养液培养Vero细胞,将细胞培
养瓶置于37℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱中培养12h~24h,然后在倒置显微镜下观察到细胞生
长至单层且能达到80%~90%密度时,可进行待检样品接种。
9.3.2 样品接种
弃掉细胞培养液,贴近细胞培养瓶侧壁缓慢加入3mLPBS轻柔漂洗3次后,取7.3.2或7.3.3中处
理好的样品上清液1mL,经0.22μm 微孔滤器过滤,接种于Vero细胞,置于37℃、5%(体积分数)二氧
化碳培养箱中吸附1h(每15min轻柔晃动细胞瓶5s),弃掉样品上清液并加入6mL含2%新生牛血
清的DMEM 培养液,置于37 ℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱中继续培养,每天在倒置显微镜下观
察细胞状态并记录细胞病变结果,连续观察2d~4d。
9.3.3 病毒培养
CDV 在Vero细胞上,一般培养2d~4d后,出现细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成的情况,随
后形成合胞体,并在胞浆中出现包涵体等CPE。如果样品初次接种Vero细胞,培养4d后无CPE,应
取1mL细胞培养瓶中的细胞培养液,移入新的细胞培养瓶内(第2代),置于37 ℃、5%(体积分数)二
氧化碳培养箱中培养4d,每天在倒置显微镜下观察细胞状态并记录细胞病变结果,是否出现CPE。无
CPE的样品培养物应盲传3代。
9.3.4 病毒鉴定
对初次接种样品或盲传3 代后出现CPE 的培养物,将细胞培养瓶用封口膜封住瓶口后放入
-70℃冰箱中,反复冻融两次后,取细胞培养液置于10mL离心管中,4 ℃ 3000r/min离心20min
后,取上清液待检。采用第10章、第12章、第13章中任何一项方法,进行CDV 鉴定。
9.4 结果判定
9.4.1 初次接种样品或盲传3代后出现CPE,并经过第10章、第12章、第13章中任何一项方法,检测
结果为阳性,判为CDV 分离阳性。
9.4.2 初次接种样品和盲传3代后均未出现CPE,或出现CPE但经过第10章、第12章、第13章中任
何一项方法,检测结果为阴性,判为CDV 分离阴性。
10 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)
10.1 器材
10.1.1 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)。
10.1.2 二氧化碳培养箱(37℃)。
10.1.3 Ⅱ级生物安全柜。
10.1.4 恒温培养箱(5℃~100℃)。
10.1.5 倒置显微镜。
5
GB/T27532—2024
10.1.6 96孔细胞培养板。
10.1.7 0.22μm 微孔滤器。
10.2 试剂
10.2.1 PBS,按照A.1配制。
10.2.2 DMEM 培养液,按照A.4配制。
10.2.3 4%多聚甲醛:4℃保存。
10.2.4 80%冷丙酮,按照A.5配制。
10.2.5 CDV 阳性血清:商品化阳性血清或具有同等效力的阳性血清,使用前稀释至工作浓度。
10.2.6 CDV 阴性血清:无CDV 抗体血清。
10.2.7 酶结合物:HRP标记的葡萄球菌A 蛋白(SPA),使用前稀释至工作浓度。
10.2.8 DAB显色液,按照A.6配制。
10.2.9 新生牛血清。
10.2.10 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。
10.3 操作方法
10.3.1 将Vero细胞稀释至1×105 个细胞/mL,在96孔细胞培养板每孔中加入0.1mL细胞稀释液及
0.1mL含5%新生牛血清的DMEM 培养液,置于37℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱中培养12h~
24h。
10.3.2 弃掉细胞培养液,PBS漂洗3次。
10.3.3 取0.1mLCDV 分离毒株接种于细胞孔中,作为阳性对照;取0.1mLDMEM 培养液加入细胞
孔中,作为阴性对照;取7.3.2或7.3.3中处理好的待检样品0.1mL,经0.22μm 微孔滤器过滤,接种于
细胞孔中;每孔加入0.1mL含5%新生牛血清的DMEM 培养液,置于37℃、5%(体积分数)二氧化碳
培养箱中培养2d~4d,或培养至阳性对照细胞孔中细胞病变达到50%时。
10.3.4 弃掉细胞培养液,PBS漂洗3次,每次2min~3min,在吸水纸上轻轻拍干。
10.3.5 每孔滴加预冷的4%多聚甲醛或80%冷丙酮并完全覆盖细胞培养板底部,室温(约20℃)固定
40min。
10.3.6 弃掉多聚甲醛或冷丙酮,PBS漂洗1次,每次2min~3min,在吸水纸上轻轻拍干。
10.3.7 将稀释后的阳性及阴性血清分别滴加到阳性对照细胞孔、阴性对照细胞孔及待检样品细胞孔
中,置于湿盒内,在37℃恒温培养箱中孵育40min~60min。
10.3.8 弃掉细胞孔中血清,PBS漂洗3次,每次5min,在吸水纸上轻轻拍干。
10.3.9 每孔滴加稀释的酶结合物并完全覆盖细胞培养板底部,置于湿盒内,在37 ℃恒温培养箱中孵
育40min~60min。
10.3.10 弃掉细胞孔中酶结合物,PBS漂洗3次,每次5min,在吸水纸上轻轻拍干。
10.3.11 每孔滴加新鲜配制的DAB 显色液并完全覆盖细胞培养板底部,室温(约20 ℃)避光显色
5min~15min。
10.3.12 弃掉细胞孔中DAB显色液,加入蒸馏水充分洗涤以终止反应。
10.3.13 在吸水纸上轻轻拍干后,在倒置显微镜下,观察判定结果。
10.4 结果判定
10.4.1 若CDV 阴性血清与正常细胞和CDV 分离毒株感染细胞反应均无色,则阴性对照成立;若
CDV阳性血清与正常细胞反应无色,与CDV 分离毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色,则阳性对照
成立。
6
GB/T27532—2024
10.4.2 在阴、阳性对照成立条件下,样品接种细胞与CDV 阳性血清和阴性血清反应均呈无色,判为
CDV 阴性。
10.4.3 在阴、阳性对照成立条件下,样品接种细胞与CDV 阴性血清反应呈无色,与CDV 阳性血清反
应呈棕黄色或棕褐色,判为CDV 阳性。
11 免疫酶组织化学试验
11.1 器材
11.1.1 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)。
11.1.2 恒温培养箱(5℃~100℃)。
11.1.3 石蜡组织切片机。
11.1.4 组织脱水机。
11.1.5 包埋机。
11.1.6 普通光学显微镜。
11.2 试剂
11.2.1 PBS,按照A.1配制。
11.2.2 DAB显色液,按照A.6配制。
11.2.3 不同体积分数乙醇溶液,按照A.7配制。
11.2.4 三氯甲烷:4℃保存。
11.2.5 二甲苯:避光密封保存。
11.2.6 软蜡:熔点56℃。
11.2.7 硬蜡:熔点60℃。
11.2.8 胰蛋白酶溶液(0.5%),按照A.8配制。
11.2.9 过氧化氢甲醇溶液(3%),按照A.9配制。
11.2.10 5%牛血清白蛋白(BSA),按照A.10配制。
11.2.11 CDV 单克隆抗体:商品化单克隆抗体或具有同等效力的一抗,使用前稀释至工作浓度。
11.2.12 CDV 阴性血清:无CDV 抗体血清。
11.2.13 酶标二抗:商品化HRP标记的二抗,使用前稀释至工作浓度。
11.3 操作方法
11.3.1 设置CDV 阳性和阴性对照组织切片。
11.3.2 按照如下步骤制备石蜡切片。
a) 脱甲醛:将7.3.3中固定好的待检组织样品放入染色缸中,用缓慢流动的自来水漂洗24h。
b) 脱水:将组织样品放入染色缸中,依次按照以下梯度浸泡脱水,放入75%(体积分数)乙醇溶液
2h,85%(体积分数)乙醇溶液2h,95%(体积分数)乙醇溶液2h,然后再放入新的95%(体积
分数)乙醇溶液2h,放入无水乙醇2h,最后放入新的无水乙醇2h。
c) 透明:将组织样品放入三氯甲烷中浸泡2.5h或二甲苯中浸泡20min,然后放入新的三氯甲烷
中浸泡3h或新的二甲苯中浸泡10min。
d) 浸蜡:在60℃条件下,将组织样品在软蜡中浸泡40min,再放入新的软蜡中浸泡1h,最后在
硬蜡中浸泡1h。
e) 包埋:将熔化的新硬蜡倒入包埋模具中,倒满后放入浸蜡处理过的组织样品,做好标记。
f) 切片:石蜡组织切成5μm 厚的薄片,用防脱片剂处理过的载玻片贴片,载玻片上做好标记。
7
GB/T27532—2024
g) 烤片:室温下晾干后,50℃烘烤4h以上,制成石蜡切片。
11.3.3 脱蜡和脱二甲苯:将11.3.2中制备的待检组织切片与阴、阳性对照切片依次放入以下试剂
中,放入二甲苯10min,新的二甲苯10min,无水乙醇2min,新的无水乙醇2min,95%(体积分数)乙
醇溶液2min,新的95%(体积分数)乙醇溶液2min,85%(体积分数)乙醇溶液2min,75%(体积分数)
乙醇溶液2min,最后蒸馏水冲洗2min。
11.3.4 第一次漂洗:将玻片置于PBS中(溶液没过组织),漂洗3次,每次5min。
11.3.5 胰蛋白酶消化:在玻片上滴加胰蛋白酶溶液并完全覆盖组织,置于湿盒内,在37℃恒温培养箱
中孵育15min,以便充分暴露抗原。
11.3.6 同11.3.4进行第二次漂洗。
11.3.7 去内源酶:在玻片上滴加过氧化氢甲醇溶液并完全覆盖组织,置于湿盒内,室温孵育5min~
10min。
11.3.8 同11.3.4进行第三次漂洗。
11.3.9 封闭:在玻片上滴加5%牛血清白蛋白并完全覆盖组织,置于湿盒内,室温孵育20 min~
30min。
11.3.10 一抗作用:弃去牛血清白蛋白,用吸水纸吸干组织周围液体,将稀释的CDV 单克隆抗体和阴
性血清分别滴加到正常组织石蜡切片、CDV 感染阳性组织石蜡切片及待检组织石蜡切片上并完全覆盖
组织,置于湿盒内,在37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃过夜(12h以上)。
11.3.11 同11.3.4进行第四次漂洗。
11.3.12 酶标二抗作用:用吸水纸吸干组织周围液体,在玻片上滴加稀释的商品化HRP标记的二抗并
完全覆盖组织,置于湿盒内,室温孵育30min~60min。
11.3.13 同11.3.4进行第五次漂洗。
11.3.14 DAB显色:用吸水纸吸干组织周围液体,在玻片上滴加新鲜配制的DAB显色液并完全覆盖组
织,置于湿盒内,室温避光显色5min~15min。
11.3.15 漂洗:将玻片置于蒸馏水中(溶液没过组织),漂洗3次,每次5min,充分洗涤以终止反应。
11.3.16 苏木素复染:玻片置于苏木素染液中染色3min~5min后,在蒸馏水中漂洗5min。
11.3.17 封片:75%(体积分数)乙醇溶液3min,85%(体积分数)乙醇溶液3min,90%(体积分数)乙醇
溶液3min,95%(体积分数)乙醇溶液3min,100%(体积分数)乙醇溶液3min,二甲苯Ⅰ 3min,二甲
苯Ⅱ3min,用中性树胶封片。
11.3.18 观察:在普通光学显微镜下观察有无黄色或棕黄色着染,及其存在部位。
11.4 结果判定
11.4.1 若CDV 阴性血清与阴性对照和CDV 阳性对照作用后均无着染;CDV 阳性血清与阴性对照作
用无着染,与CDV 阳性对照作用后呈本底清晰,细胞浆内呈现黄色或棕黄色着染,则试验成立。
11.4.2 在试验成立条件下,被检组织与CDV 阳性血清作用后本底清晰,组织内无黄色或棕黄色着
染,判为CDV 阴性。
11.4.3 在试验成立条件下,被检组织与CDV 阳性血清作用后本底清晰,组织内呈黄色或棕黄色着
染,判为CDV 阳性。
12 RT-PCR
12.1 器材
12.1.1 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)。
12.1.2 PCR仪。
8
GB/T27532—2024
12.1.3 高速冷冻离心机(4℃、离心速度12000r/min以上)。
12.1.4 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。
12.1.5 凝胶成像系统。
12.1.6 微量可调移液器(100μL~1000μL、20μL~200μL、1μL~20μL)。
12.1.7 无RNA 酶离心管与带滤芯吸头。
12.2 试剂
12.2.1 Trizol试剂:RNA 提取试剂,2 ℃~8 ℃保存,也可用商品化RNA 提取试剂盒,或其他等效
RNA 提取试剂和方法,如自动化核酸提取仪和其他配套核酸抽提试剂进行核酸提取。
12.2.2 三氯甲烷:4℃保存。
12.2.3 异丙醇:使用前预冷至-20℃。
12.2.4 DEPC水(0.1%),按照A.11配制。
12.2.5 75%(体积分数)乙醇:用新开启的无水乙醇75mL加25mLDEPC水配制成75%(体积分数)
乙醇溶液,使用前预冷至-20℃。
12.2.6 RT-PCR相关试剂:可选择商品化试剂盒,操作步骤按照说明书进行。
12.2.7 10×RT-PCRBuffer:反应缓冲液,MgCl2,dNTPMix。
12.2.8 RTEnzymeMix:逆转录酶,RNase抑制剂,Taq 酶。
12.2.9 5×TBE电泳缓冲液,按照A.12配制。
12.3 CDV 阴性对照制备
用DEPC水作为CDV 阴性对照。
12.4 CDV 阳性对照制备
用CDV 细胞培养物作为CDV 阳性对照。
12.5 操作方法
12.5.1 引物设计
用于检测CDV 的引物序列见附录B中B.1。
12.5.2 RNA 提取
12.5.2.1 取1.5mL无RNA 酶离心管,按照样本数量编号,每管加入750μLTrizol试剂后,分别加入
7.3中处理好的待检样品上清液、CDV 阴性对照及CDV 阳性对照250μL,用带滤芯吸头充分吹打
20次~30次,4℃12000r/min离心10min。
12.5.2.2 取上清液(至少500μL)至新的1.5mL无RNA 酶离心管中,每管加入150μL三氯甲烷,于
混匀器上混匀15s,4℃12000r/min离心15min。
12.5.2.3 取上清液至新的1.5mL 无RNA 酶离心管中,每管加入500μL 异丙醇,颠倒数次混合均
匀,冰上静置10min,4℃12000r/min离心10min。
12.5.2.4 小心弃掉上清液,倒置在干净的吸水纸上晾干水分,沉淀用1mLDEPC水配制的75%(体积
分数)乙醇清洗;4℃8000r/min离心10min。
12.5.2.5 小心弃掉上清液,倒置在干净的吸水纸上室温自然干燥10min,加入20μLDEPC水溶解
RNA 沉淀。
12.5.2.6 置于冰上备用,并于2h内进行RT-PCR扩增,超过2h应置于-70℃冰箱中保存。
9
GB/T27532—2024
12.5.2.7 可使用等效的商品化试剂盒进行RNA 提取。
12.5.3 RT-PCR 反应体系
RT-PCR反应体系按照表1。
表1 RT-PCR 反应体系(总体积为20μL)
序号试剂体积/μL
1 10×RT-PCRBuffer 2
2 RTEnzymeMix 0.4
3 上游引物(CDVF,20μmol/L) 0.5
4 下游引物(CDVR,20μmol/L) 0.5
5 RNA模板5
6 DEPC水11.6
12.5.4 反应程序
将PCR管置PCR 仪上按如下程序扩增:42 ℃反转录30 min;94 ℃预变性2 min;94 ℃ 变性
30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,进行35个循环;最后72℃延伸3min。
12.5.5 琼脂糖凝胶电泳
用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶平板,将凝胶平板放入水平电泳槽中,使电泳缓冲液刚
好没过胶面,将10μLPCR 产物和2μL加样缓冲液(6×)混匀后缓慢加入样品孔中。电泳时应设立
DNA 标准分子量对照。在120V、90mA 条件下电泳约30min,电泳结束后,用凝胶成像系统观察
结果。
12.6 结果判定
12.6.1 CDV 阳性对照样品扩增出大小为455bp的核酸片段,且阴性对照样品无扩增条带,则阴、阳性
对照成立;否则试验结果无效,电泳图见附录C。
12.6.2 在阴、阳性对照成立条件下,若待检样品扩增出大小为455bp的核酸片段,判为CDV 核酸阳
性;若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为455bp,判为CDV 核酸阴性。
13 荧光RT-PCR
13.1 器材
13.1.1 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)。
13.1.2 荧光PCR仪。
13.1.3 高速冷冻离心机(4℃、离心速度12000r/min以上)。
13.1.4 微量可调移液器(100μL~1000μL、20μL~200μL、1μL~20μL)。
13.1.5 无RNA 酶离心管与带滤芯吸头。
10
GB/T27532—2024
13.2 试剂
13.2.1 DEPC水(0.1%),按照A.11配制。
13.2.2 10×RT-PCRBuffer:反应缓冲液,MgCl2,dNTPMix。
13.2.3 RTEnzymeMix:逆转录酶,RNase抑制剂,Taq 酶。
13.3 操作方法
13.3.1 引物和探针设计
用于检测CDV 的引物和探针序列见B.2。
13.3.2 RNA 提取
操作步骤同12.5.2。
13.3.3 荧光RT-PCR 反应体系
荧光RT-PCR反应体系按照表2。
表2 荧光RT-PCR 反应体系(总体积为20μL)
序号试剂体积/μL
1 10×RT-PCRBuffer 2
2 RTEnzymeMix 0.4
3 上游引物(PrimerF,10μmol/L) 0.5
4 下游引物(PrimerR,10μmol/L) 0.5
5 PrimerP(5μmol/L) 0.5
6 RNA模板5
7 DEPC水11.1
13.3.4 反应程序
将PCR管置荧光PCR仪上按如下程序扩增:48 ℃反转录10min;95 ℃预变性3min;95 ℃变性
10s,60℃退火延伸30s;进行40个循环,每个循环在60℃收集FAM 荧光。
13.4 结果判定
13.4.1 试验成立条件
13.4.1.1 阴性对照无Ct值或Ct≥40,且无特定的S型扩增曲线。
13.4.1.2 阳性对照的Ct<35,且出现特定的S型扩增曲线。
13.4.1.3 阴性对照和阳性对照同时满足以上条件可判定试验有效,否则试验无效。
13.4.2 结果描述与判定
13.4.2.1 无Ct值或Ct≥40,且无特定的S型扩增曲线,判为CDV 核酸阴性。
13.4.2.2 Ct≤38,且出现特定的S型扩增曲线,判为CDV 核酸阳性,扩增曲线图见附录D。
11
GB/T27532—2024
13.4.2.3 38<ct<40且出现特定的s型扩增曲线,判为可疑。在排除样品或产物污染的可能性后,重
新提取核酸检测,无Ct值或Ct≥40且无特定的S型扩增曲线,判为CDV 核酸阴性,Ct<40且出现特
定的S型扩增曲线,判为CDV 核酸阳性。
14 综合判定
14.1 经过第6章临床诊断,判为疑似CD;符合6.2其中一项的活体动物可采用第8章进行快速诊
断,检测结果为阳性者,判为疑似CD。
14.2 疑似CD病例按照第9章~第13章中任何一项方法检测结果为阳性,判为CD确诊病例。
14.3 对于无6.2中临床症状的动物,按照第9章~第13章中任何一项方法检测结果为阳性,若未接种
过CD疫苗,判为CDV 感染;若2周~3周内接种过CD活疫苗,应进一步采用第12章方法进行检测并
对扩增片段进行序列测定,以区分疫苗毒株或野毒株感染。
12
GB/T27532—2024
附 录 A
(规范性)
试剂溶液的配制
A.1 0.01mol/LpH7.4PBS
配制0.01mol/LpH7.4PBS所需试剂如下:
———8g氯化钠;
———0.2g氯化钾;
———0.24g磷酸二氢钾;
———1.44g磷酸氢二钠。
试剂加800mL蒸馏水充分溶解,用浓盐酸调节pH 至7.4后,加蒸馏水至1000mL,高压灭菌,
4℃保存备用。
A.2 青链霉素贮存液
取注射用青霉素和链霉素溶解于蒸馏水中,使每毫升含青霉素50000U、链霉素50000μg,用
0.22μm微孔滤器过滤,-20℃保存备用。使用时,按100mLDMEM 培养液加0.2mL青链霉素贮存
液的比例,使最终浓度为青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL。
A.3 10%中性福尔马林固定液
配制10%中性福尔马林固定液所需试剂如下:
———4.0g磷酸二氢钠;
———6.5g磷酸氢二钠;
———100mL 甲醛;
———900mL 蒸馏水。
充分溶解混匀,室温保存备用。
A.4 DMEM 培养液
将DMEM 粉剂10g,加入950mL的30℃蒸馏水中,边加边搅拌,加入3.7g碳酸氢钠,充分溶解
后,用1mol/L氢氧化钠或盐酸将培养液pH 调至6.9~7.0后,加蒸馏水至1000mL。立即用0.22μm
的微孔滤器过滤,盖紧容器瓶塞,4℃保存备用。
A.5 80%冷丙酮
将8mL丙酮与2mL蒸馏水混匀,4℃保存备用。
A.6 DAB显色液
先在1mL蒸馏水中加入50μLDAB试剂中的A 液混匀,再加入50μLB液和50μLC液充分混
匀使用,现用现配。
A.7 不同体积分数乙醇溶液
用纯化水和无水乙醇按比例配制成不同体积分数的乙醇溶液,室温保存备用。
13
GB/T27532—2024
A.8 胰蛋白酶溶液(0.5%)
配制胰蛋白酶溶液(0.5%)所需试剂如下:
———0.5g胰蛋白酶;
———100mLPBS。
低温保存备用。使用时,用PBS稀释为0.05%。
A.9 过氧化氢甲醇溶液(3%)
将10mL30%过氧化氢与90mL甲醇混匀,现用现配。
A.10 5%牛血清白蛋白(BSA)
称取5gBSA 粉末,将BSA 粉末缓慢地加入100mL生理盐水中,搅拌均匀,至BSA 粉末完全溶
解,4℃保存备用。
A.11 DEPC水(0.1%)
在通风橱内,将1mLDEPC加入999mL双蒸水中,经剧烈振摇后,于室温静止4h以上,使DEPC
充分溶解。高压灭菌121℃30min后,4℃保存备用。
A.12 5×TBE电泳缓冲液
配制5×TBE电泳缓冲液所需试剂如下:
———54.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris);
———2.9g乙二胺四乙酸(EDTA);
———27.5g硼酸。
试剂加800mL蒸馏水,用5mol/L的盐酸调pH 至8.0后,加蒸馏水至1000mL。
14
GB/T27532—2024
附 录 B
(资料性)
RT-PCR、荧光RT-PCR 引物和探针序列
B.1 RT-PCR 引物序列
引物浓度为20μmol/L,其序列如下:
上游引物(CDVF):5'-CGAGTCTTTGAGATAGGGTT-3';
下游引物(CDVR):5'-CCTCCAAAGGGTTCCCATGA-3'。
B.2 荧光RT-PCR 引物和探针序列
采用TaqMan探针法。其序列如下:
上游引物(PrimerF):5'-AGCTAGTTTCATCTTAACTATCAAATT-3';
下游引物(PrimerR):5'-TTAACTCTCCGGAAAACTCATGC-3';
PrimerP:5'-(FAM)ACCCRAGAGCCGGATACATAGTTTCAATGC(BHQ1)-3'。
15
GB/T27532—2024
附 录 C
(资料性)
犬瘟热病毒RT-PCR 反应产物电泳图
犬瘟热病毒RT-PCR反应产物电泳结果如图C.1所示。
标引序号说明:
M ———DNA分子质量标准DL2000;
1 ———阴性对照;
2 ———阳性对照;
3、4、5 ———阳性样品。
图C.1 犬瘟热病毒RT-PCR 电泳图
16
GB/T27532—2024
附 录 D
(资料性)
犬瘟热病毒荧光RT-PCR 扩增曲线图
犬瘟热病毒荧光RT-PCR扩增曲线图如图D.1所示。
标引序号说明:
1———阴性对照;
2———阳性对照。
图D.1 犬瘟热病毒荧光RT-PCR 扩增曲线图</ct<40且出现特定的s型扩增曲线,判为可疑。在排除样品或产物污染的可能性后,重