T/CVMA 176-2024 猫支气管败血波氏菌感染诊断技术规范

ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 176—2024
猫支气管败血波氏菌感染诊断技术规范
Technical specification for diagnosis of feline Bordetella bronchisetica infection
2024 - 9 - 9发布2024 - 9 - 9实施
中国兽医协会 发布

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、上海基灵生物科技有限公司、东莞博盛生物科技有限公司、北京市动物疫病预防控制中心、潍坊市动物疫病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心、广州源博医药科技有限公司、天津市动物疫病预防控制中心、天津农垦康嘉生态养殖有限公司。
本文件主要起草人：梁瑞英、朱向东、梁琳、汤新明、丁家波、朱旭、王弋、刘昕、张启龙、贾婷、刘存、刘砚涵、孙燕、赖强、金红岩、赵洪进。

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猫支气管败血波氏菌感染诊断技术规范
1 范围
本文件规定了猫支气管败血波氏菌感染的流行病学、临床诊断、生化鉴定、以及PCR和荧光PCR实验室诊断的技术规范。
本文件适用于猫支气管败血波氏菌感染的诊断。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
GB/T 40365 细菌无菌检测通则
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bb：支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）
Ct：每个反应管内的荧光信号量达到设定阈值所经历的循环数（Cycle Threshold）
DHL：胆硫乳琼脂（Deoxychilate Hydrogen Sulfide Lactose Agar）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）
实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction）
5 临床诊断
5.1 流行病学
5.1.1 患病猫接触感染支气管败血波氏菌的猫或患病猫使用过的用具。
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5.1.2 患病猫发病前生活环境发生改变，比如寄养、更换住处、运输、进入多猫环境或去过医院。
5.1.3 过度拥挤、应激及卫生状况不良易诱发感染。
5.1.4 接触感染支气管败血波氏菌的犬，感染在犬和猫之间传播。
5.2 临床症状
5.2.1 患病猫出现发热、打喷嚏、眼睛分泌物增多、咳嗽等症状至少出现一种。
5.2.2 肺脏呼吸音增大、淋巴结肿大。
5.2.3 少数严重病例出现肺炎、呼吸困难及紫绀中的一种或者一种以上的症状。
5.3 结果判定
患病猫出现5.1和5.2中的任一项，可初步判定为支气管败血波氏菌感染疑似病例，需要进一步做实验室诊断。
6 样品采集、保存、运输及处理
6.1 样品采集
将无菌棉拭子用灭菌生理盐水充分浸润，采集眼、鼻和咽拭子样本或气管灌洗液。眼部应采集结膜囊内黏膜分泌物；深入鼻腔内部贴壁采集鼻腔黏膜分泌物；咽部拭子采集咽喉深处黏膜分泌物。将采集后拭子放入已装好细菌保存液的商品化样本收集管内（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液），折断手柄，随即密封即完成取样；气管灌洗液置于无菌管。编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时添加冰袋保持低温。
6.2 样品保存、运输
6.2.1 用于细菌分离鉴定的样品置于4℃保存，应在24 h之内送检。
6.2.2 用于核酸检测的样本，24 h之内检测样本可置于4 ℃保存，24 h内无法检测的样本于-70 ℃或以下保存，如无-70 ℃保存条件，可置于-20 ℃冰箱暂存。
6.3 样品处理
6.3.1 根据情况，向收集的拭子样品中，加入适量PBS缓冲液（PBS按附录B.1配制），制备悬液。
6.3.2 用无菌接种环，取适量重悬PBS或气管灌洗液直接划线接种血琼脂平皿和DHL琼脂平皿。
6.3.3 取200 μL PBS悬液或气管灌洗液用于核酸提取。
7 细菌的分离与鉴定
7.1 仪器
7.1.1 生物安全柜。
7.1.2 恒温培养箱。
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7.1.3 显微镜。
7.1.4 高压灭菌锅。
7.1.5 恒温震荡培养箱。
7.1.6 离心机。
7.1.7 移液器。
7.2 试剂和耗材
7.2.1 血琼脂平皿。
7.2.2 DHL琼脂平皿。
7.2.3 盖玻片。
7.2.4 载玻片。
7.2.5 移液器枪头。
7.2.6 革兰氏染色试剂盒。
7.2.7 无菌水。
7.2.8 酒精灯。
7.2.9 微量生化管。
7.3 分离培养
划线接种的血琼脂平皿和DHL琼脂平皿置于37℃培养24 h ~ 48 h。
7.4 鉴定
7.4.1 菌落特征
支气管败血波氏菌在血琼脂平皿上形成1 mm左右、灰白色、带有轻微α溶血的菌落；DHL琼脂平皿上可形成无色半透明、2 mm左右的菌落。
7.4.2 菌体特征
7.4.2.1 涂片
载玻片上滴加1 ~ 2 滴灭菌蒸馏水后，挑取单菌落与灭菌水混匀并涂成薄菌膜。
7.4.2.2 干燥
将涂片于空气中自然晾干。
7.4.2.3 固定
将已干燥的载玻片涂面朝上，在酒精灯火焰上方通过5 ~ 6 次进行固定。
7.4.2.4 染色
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具体操作步骤按照革兰氏染色试剂盒说明书进行。
7.4.2.5 镜检结果
置1000倍（10×100倍）光学显微镜下观察：革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小约0.2μm ~ 0. 3 μm × 0.5μm ~1.0 μm，染色均匀，两端钝圆，有鞭毛，无芽孢。
7.4.3 生化试验
7.4.3.1 生化试验操作
用接种环挑取疑似菌落，接种于微量生化反应管，置于37 ℃培养箱，相关试验操作说明见附录A。
7.4.3.2 生化试验结果
7.4.3.2.1 不发酵葡萄糖、蔗糖等碳水化合物。
7.4.3.2.2 不产生硫化氢。
7.4.3.2.3 不发酵山梨醇、甘露醇。
7.4.3.2.4 尿素试验阳性：分离菌产碱。
7.4.3.2.5 甲基红、V-P（Voges-Proskauer）试验均为阴性。
7.4.3.2.6 三糖铁斜面底部不变色。
7.4.3.2.7 能利用枸橼酸盐。
7.4.3.2.8 氧化酶反应为阳性。
7.5 结果判定
将涂片于空气中自然晾干。待检菌种符合7.4.1和7.4.2.5中的任一项，且满足7.4.3.2结果，可初步判定猫感染支气管败血波氏菌。
8 支气管败血波氏菌的PCR检测
8.1 仪器
8.1.1 PCR扩增仪。
8.1.2 高速台式冷冻离心机。
8.1.3 生物安全柜。
8.1.4 移液器。
8.1.5 电泳仪。
8.1.6 电泳槽。
8.1.7 紫外凝胶成像仪。
8.2 耗材
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8.2.1 离心管（1.5 μL、200 μL）。
8.2.2 移液器枪头（2.5 μL、10 μL、100 μL）。
8.3 试剂
8.3.1 试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T 6682中一级水的要求。
8.3.2 无水乙醇。
8.3.3 10 % SDS：配方见附录B.2。
8.3.4 蛋白酶K贮备液：配方见附录B.3。
8.3.5 TAE电泳缓冲液：配方见附录B.4。
8.3.6 TBE电泳缓冲液：配方见附录B.5。
8.3.7 商品化核酸提取试剂盒。
8.4 引物
支气管败血波氏菌PCR扩增引物序列见附录C.1。
8.5 支气管败血波氏菌核酸提取
8.5.1 取200 μL 5.3样品处理液，加人25 μL 10% SDS和10 μL 的20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育2 h。
8.5.2 放置到室温，加入等量的饱和酚溶液500 μL，振荡混匀20 s，10000 g 离心5 min，取上清液。
8.5.3 加入等量的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），振荡混匀20 s，10000 g，离心5 min，取上清液。
8.5.4 再加入等量的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混匀20 s，10000 g 离心5 min，取上清液。
8.5.5 加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，10000 g离心10 min，弃上清液。
8.5.6 室温干燥后，加入30 μL RNase-free水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃贮存备用。
8.5.7 可采用同等提取效果的其他方法或使用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒。
8.6 PCR扩增
取7.5步骤提取的细菌核酸，进行PCR扩增检测，PCR反应体系及反应参数见附录C.2和C.3。
8.7 扩增产物电泳检测
8.7.1 样品制备：分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物8 μL与2 μL 5×上样缓冲液混合均匀，加入核酸凝胶样品孔，核酸凝胶配置见附录A5。
8.7.2 加样：分别取10 μL DNA Marker、PCR扩增产物、阴、阳性对照扩增产物，加入凝胶孔。
8.7.3 电泳：5 V/cm恒压下电泳30 min，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
8.8 有效原则
8.8.1 阳性对照：PCR产物有1532 bp的特异性核酸条带。
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8.8.2 阴性对照：PCR产物无核酸条带。
8.8.3 8.8.1和8.8.2在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。
8.9 结果判定
在实验有效的前提下，被检样品的PCR产物电泳后在1532 bp位置出现特异性条带，判定为支气管败血波氏菌核酸阳性，否则判定为阴性。
9 支气管败血波氏菌的荧光PCR检测
9.1 仪器
9.1.1 荧光定量PCR仪。
9.1.2 其他仪器设备同支气管败血波氏菌的PCR检测设备。
9.2 引物探针和阳性对照
荧光PCR引物探针序列见附录D.1。阳性对照的制备见附录E。
9.3 支气管败血波氏菌DNA提取
方法同7.5。
9.4 荧光PCR操作步骤
9.4.1 荧光PCR扩增试剂的准备与配制
配备荧光PCR扩增试剂，根据被检样品数量，按照推荐的反应液配方（见附录D.2）配制反应液，充分混合均匀后分装，每个反应管15 μL。
9.4.2 加样
将9.4.1配好的反应管中分别加入9.3中制备的DNA核酸溶液2 μL（约500 ng），使每管总体积达到20 μL，阳性对照组加入1 μL制备的阳性标准质粒，阴性对照组加入1 μL灭菌水，记录反应管对应的样品编号，盖紧管盖后，500 g离心30 s。
9.4.3 荧光PCR反应设定
将9.4.2中加样后的反应管放入荧光定量PCR仪内，编辑样品表后，选定与探针标记荧光基团相符合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。推荐的荧光PCR反应参数见D.3。
9.4.4 结果判定
9.4.4.1 确定阈值
读取检测结果，阈值设定原则以大于样本荧光背景值，并超过阴性对照扩增曲线的最高值为标准，可根据不同仪器噪声进行调整。
9.4.4.2 质控标准
阴性对照无特异性扩增曲线，阳性对照为典型的“S”型扩增曲线，且Ct值≤30。
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9.4.4.3 阳性
若被检样品在相应通道Ct值＜35且出现特异性扩增曲线，判定被检样品支气管败血波氏菌核酸阳性。
9.4.4.4 阴性
若被检样品在相应通道无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品支气管败血波氏菌核酸阴性。
9.4.4.5 可疑
被检样品在相应通道35≤Ct值≤38时，且出现特异性扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct 值≤38，扩增曲线有明显起峰，则判为支气管败血波氏菌核酸阳性；无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品支气管败血波氏菌核酸阴性。
10 诊断原则
猫感染支气管败血波氏菌的诊断是以病原学检查为主，结合流行病学史、临床症状、实验室检测进行综合分析做出诊断。
11 诊断注意事项
11.1 猫群中支气管败血波氏菌无症状携带率较高，气管灌洗液中鉴定到支气管败血波氏菌具有重要诊断意义。
11.2 慢性带菌者排出的病原量较少，有必要重复采集口咽部拭子样品进行培养和鉴定。
12 诊断结果判定
满足细菌分离鉴定、PCR检测和荧光PCR检测结果阳性的任一项，可判定猫感染支气管败血波氏菌。
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附 录 A （规范性） 生化试验操作及结果判定
支气管败血波氏菌生化试验操作及结果判定见表A.1。
表A.1 支气管败血波氏菌生化试验操作及结果判定
生化项目
微量生化管
反应时间
操作说明
实验结果
葡萄糖
葡萄糖
8~24 h
37℃培养箱培养
-
蔗糖
蔗糖
8~24 h
37℃培养箱培养
-
山梨醇
山梨醇
8~24 h
37℃培养箱培养
-
甘露醇
甘露醇
8~24 h
37℃培养箱培养
-
半固体
半固体琼脂
24 h
37℃培养箱培养
+
硫化氢
硫化氢
6~24 h
37℃培养箱培养
-
尿素
尿素
12~24 h
37℃培养箱培养
+
明胶
明胶
48~72 h
培养箱取出后，置于4℃冰箱内10 min后，取出立即观察，观察时将其倒置，轻弹生化管，观察是否有液体流动。
-
靓基质
蛋白胨水
18~24 h
加靓基质试剂1~2滴
-
甲基红
葡萄糖磷酸盐胨水
24~28 h
加甲基红试剂1~2滴，置35℃培养箱10~20 min。
-
吲哚
葡萄糖磷酸盐胨水
24~28 h
加6%甲萘酚酒精溶液2滴，颠倒生化管3~5次，加40%NaOH溶液1滴，颠倒生化管3~5次，置35℃培养箱15~30 min。
-
三糖铁
三糖铁斜面培养基
20~24 h
37℃培养箱培养
-
枸橼酸
西蒙氏枸橼酸盐
24~28 h
37℃培养箱培养
+
触酶
TSA平板
24
滴3%~10%H2O2 1滴到菌落上
+
氧化酶
氧化酶试纸
10 s
直接用滤纸蘸取菌落，10~20 s
+
硝酸盐
硝酸盐（还原）
18~24 h
硝酸盐还原试剂甲、乙液混合均匀，加入1~2滴
+
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附 录 B （资料性） 试剂配方
B.1 pH7.2，0.01 mol/L PBS的配制
B.1.1 25×PB的配制
称量2.74 g磷酸氢二钠和0.79 g磷酸二氢钠，加蒸馏水溶解，最后定容至100 mL。
B.1.2 1×PBS的配制
量取40mL 25×PB，加入8.5 g氯化钠，加蒸馏水，最后定容至1000 mL。
B.1.3 pH7.2，0.01 mol/L PBS的配制
取1×PBS，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2，灭菌或过滤除菌，PBS一经使用，于4℃保存不应超过3周。
B.2 10% SDS
在45 mL 无菌蒸馏水溶解5 g SDS（电泳级），加热至60℃溶解，用盐酸调pH值至7.8，加无菌蒸馏水定容至50 mL。
B.3 蛋白酶K贮备液（20 mg/mL)
每升无菌蒸馏水中加入Tris 1.21 mg，EDTA 1.86 mg，SDS 5 g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升加入20 mg蛋白酶K，充分溶解后分装。
B.4 5×TAE电泳缓冲液
称量Tris 24.2 g，Na2EDTA·2H2O 3.72 g于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入5.71 mL的冰乙酸，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TAE。
B.5 5×TBE电泳缓冲液
称量Tris 54.0 g，EDTA 2.9 mg于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL 无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入硼酸27.5 g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。
B.6 核酸凝胶制备
取1.0 g 琼脂糖加入100 mL 1×TAE中加热至沸腾，充分溶化后冷却至50℃左右，加入核酸染色剂10 μL，混匀后倒入胶槽制备凝胶，凝固后置入电泳槽，加入1×TBE 核酸电泳缓冲液。
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附 录 C （规范性） PCR引物序列、反应体系及反应参数
C.1 PCR引物序列
支气管败血波氏菌PCR扩增引物序列见表C.1。
表C.1 支气管败血波氏菌PCR扩增引物序列
引物名称
基因
引物序列5’-3’
上游引物
16 S
TGAACTGAAGAGTTTGATCCT
下游引物
AAAGGAGGTGATCCAGCCGC
注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10 μmol/L, -20℃保存备用。
注2：扩增目的片段为16 S基因，长度1532 bp。
C.2 PCR检测反应体系
支气管败血波氏菌PCR检测反应体系见表C.2。
表C.2 支气管败血波氏菌PCR检测反应体系
C.3 PCR反应参数
支气管败血波氏菌PCR检测反应参数见表C.3。
表C.3 支气管败血波氏菌PCR反应参数
反应温度(℃)
反应时间
循环数
95
3min
1
95
10 s
35
55
30 s
72
1.5min
72
5min
1
试剂
终浓度
体积（μL）
2×Taq酶
\
10
上游引物
0.5 μmol/L
0.5
下游引物
0.5 μmol/L
0.5
DNA模板
\
2
灭菌去离子水
\
7
总体积
\
20
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附 录 D （规范性） 荧光PCR检测引物、反应体系及反应参数
D.1 荧光PCR引物序列
支气管败血波氏菌荧光PCR扩增引物序列见表D.1。
表D.1 支气管败血波氏菌荧光PCR扩增引物序列
引物名称
基因
序列（5’→ 3’）
Forward primer
外膜蛋白 GAACTGCAAGCAACACCACTG
Reverse primer CCATTCGGCATCTTGAAGATG
Probe FAM-CGCTGCCGACAGATCAAATTTTGCC -BHQ2
D.2 荧光PCR检测反应体系
支气管败血波氏菌荧光PCR检测反应体系见表D.2。
表D.2 支气管败血波氏菌荧光PCR检测反应体系
名称
工作液终浓度（μmol/L）
加样体积（μL）
Premix Ex Taq缓冲液
1×
10
Forward primer
0.4
1
Reverse primer
0.4
1
Probe
0.2
0.5
待检核酸
\
2
灭菌去离子水
\
5.5
总体积
\
20
D.3 荧光PCR反应参数
支气管败血波氏菌PCR检测反应参数见表D.3。
表D.3 支气管败血波氏菌荧光PCR反应参数
反应温度(℃)
反应时间
循环数
94
2 min
1
94
15 s
40
60
30 s
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附 录 E （规范性） 支气管败血波氏菌阳性对照的制备
E.1 支气管败血波氏菌16 S基因片段参考序列（GenBank Accession No. KF054765）
5’-TGAACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGGATGCTTTACACATGCAAGTCGGACGGCAGCACGGGCTTCGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGAACGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGCGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGTCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGGAAAGCACTTTTGGCAGGAAAGAAACGGCACGGGCTAATATCCTGTGCAACTGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTTAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTCCGGGCTGGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTTTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCTTCGGGCCTTGGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGATGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTCGCTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT-3＇
注：斜体加粗为PCR扩增引物。
E.2 支气管败血波氏菌外膜蛋白基因参考序列（GenBank Accession No. KY249130.1）
5’-TTGCCTGTAGGGAATCCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATGGCACTATGTGGGAAGGTGCTTCAGGAGATCCTTGTGATCCTTGTGCTACTTGGTGTGATGCTATCAGCATCCGTGCAGGATTCTCGGAGATTATGTTTTCGATCGTATATTAAAAGTTGATGTTAATAAAACCATCAGCGGAATGGCTGCGGCTCCAACAGCAGCTTCTGGAACTGCAAGCAACACCACTGTCGCTGCCGACAGATCAAATTTGCCTACGGCAAACATCTTCAAGATGCCGAATGGTGCACCAATGCTGCTTACTTAGCATTAAATATTTGGGATCGTTTTGATGTTTTCTGCACGCTAGGAGCGTCTAATGGTTACTTCAAAGCAAGTCTGATGCATTTAACCTTGTCGGATTGATTGGTCTTGCAGGA-3＇
注：黑色粗体为荧光定量PCR扩增引物和探针。
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E.3 阳性对照质粒的制备
按照E.1 和E.2中的序列合成基因片段，分别克隆至pMD19-T 载体，再转化至DH5α 感受态细胞，分别构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR 检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度（ng/μL）×10-9]/（DNA碱基数×660）），即为支气管败血波氏菌PCR和荧光PCR阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，均选取104拷贝/μL稀释度作为阳性对照。