GB/T 34750-2025 格拉瑟病诊断技术

ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国国家标准
GB/T34750—2025
代替GB/T34750—2017
格拉瑟病诊断技术
DiagnostictechniquesforGlässer’sdisease
2025-01-24发布2025-08-01实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发布

目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 缩略语…………………………………………………………………………………………………… 1
5 临床诊断………………………………………………………………………………………………… 1
6 样品采集、处理及保存…………………………………………………………………………………… 2
7 细菌分离与鉴定………………………………………………………………………………………… 3
8 巢式PCR检测…………………………………………………………………………………………… 5
9 实时荧光PCR检测……………………………………………………………………………………… 7
10 间接ELISA …………………………………………………………………………………………… 8
11 综合判定………………………………………………………………………………………………… 9
附录A (规范性) 分离培养和生化鉴定试剂的配制…………………………………………………… 11
附录B(资料性) 副猪格拉瑟菌分离鉴定图…………………………………………………………… 12
附录C(规范性) 巢式PCR和实时荧光PCR所用引物序列………………………………………… 13
附录D(资料性) 巢式PCR产物电泳图及荧光PCR扩增曲线图…………………………………… 14
附录E(资料性) 副猪格拉瑟菌重组P2蛋白的制备及鉴定………………………………………… 15
附录F(资料性) 抗体阳性对照(阳性血清)、阴性对照(阴性血清)的制备及鉴定………………… 16
附录G (规范性) 间接ELISA检测溶液配制………………………………………………………… 17
Ⅰ
GB/T34750—2025

前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本 文件代替GB/T34750—2017《副猪嗜血杆菌检测方法》,与GB/T34750—2017相比,除结构调
整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
———更改了范围(见第1章,2017年版的第1章);
———增加了临床诊断(见第5章);
———更改了样品采集、处理及保存(见第6章,2017年版的6.1);
———更改了细菌分离与鉴定的结果判定(见7.8,2017年版的6.6.7);
———更改了样品DNA 的制备(见8.3,2017年版的7.2);
———增加了间接ELISA(见第10章);
———增加了综合判定(见第11章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。
本文件起草单位:河南省动物疫病预防控制中心、河南省畜产品质量监测检验中心、中国动物卫生
与流行病学中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所。
本文件主要起草人:闫若潜、班付国、谢彩华、吴志明、苏红、程果、马震原、王淑娟、赵明军、徐引弟、
郭育培、杨海波、王翠、刘影、赵雪丽、方先珍、房大学、宋丹、赵美雪、柴茂、刘敏、张利平、刘礼杰、李蛟、
赵胜杰、冉晓龙。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
———2017年首次发布为GB/T34750—2017。
———本次为第一次修订。
Ⅲ
GB/T34750—2025

格拉瑟病诊断技术
1 范围
本文件描述了格拉瑟病的临床诊断、样品采集处理与保存、细菌分离与鉴定、巢式PCR检测、实时
荧光PCR检测、间接ELISA 等实验室诊断方法。
本文件适用于格拉瑟病的诊断、监测。
2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
Ct值:循环阈值(cyclethreshold)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates)
ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay)
IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinGs)
MGB:小沟结合(minorgroovebinder)
NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide)
PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution)
PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)
Taq 酶:TaqDNA 聚合酶(Taq DNApolymerase)
TSA:胰蛋白胨大豆琼脂(trypticsoyagar)
TSB:胰蛋白胨大豆肉汤(trypticsoybroth)
5 临床诊断
5.1 流行病学
格拉瑟病是由副猪格拉瑟菌感染引起的细菌性传染病,副猪格拉瑟菌只感染猪,病猪、带菌猪是本
病的主要传染源。不同年龄、性别和品种的猪均易感,主要发生于断奶前后和保育阶段的猪。本病一年
四季均可发生,尤其以早春和深秋季节多发。主要通过呼吸道感染,可分为急性感染和慢性感染,以慢
性感染为主。
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GB/T34750—2025
5.2 临床症状
5.2.1 急性病例
5.2.1.1 发热,体温升高到40.5℃~42℃,精神沉郁,食欲减退。
5.2.1.2 呼吸困难,鼻孔有黏液性及浆液性分泌物。
5.2.1.3 感染初期皮肤发红,后期耳廓边缘发绀。
5.2.1.4 跛行,颤抖,神经症状。
5.2.2 慢性病例
5.2.2.1 食欲下降,消瘦虚弱,被毛粗乱,生长不良。
5.2.2.2 反复发热,咳嗽,呼吸困难。
5.2.2.3 关节肿大,四肢无力或跛行。
5.3 病理变化
5.3.1 心包膜、胸膜、腹膜、关节滑膜以浆液性、纤维素性渗出为炎症特征。
5.3.2 关节肿大,关节内有浆液性、纤维性渗出物或胶冻样物。
5.3.3 胸腔内有大量的淡黄色或略带红色液体及纤维素性渗出物凝块。
5.3.4 心包积液,心包膜增厚,心包内常有干酪样渗出物,与心脏粘连在一起,形成“绒毛心”;心肌有出
血点,表面有大量纤维素渗出。
5.3.5 肺脏淤血、水肿,表面覆盖有纤维蛋白膜,与胸壁粘连。
5.3.6 浆液性或纤维素性腹膜炎,腹腔积液或内脏器官粘连。
5.3.7 全身淋巴结肿大,肝、脾、肾充血与局灶性出血。
5.4 结果判定
符合5.1,且符合5.2中3条以上(含3条),或/和符合5.3病理变化指标一条以上,判定为格拉瑟病
疑似病例,确诊需要实验室诊断。
6 样品采集、处理及保存
6.1 样品的采集及处理
6.1.1 镜检样品
无菌采集疑似副猪格拉瑟菌感染病死猪的肺脏、心脏、脑等新鲜组织,胸腔、腹腔、心包积液或关节
液,抗凝血等样品。
6.1.2 血清样品
自耳静脉或前腔静脉无菌采血,每头应不少于5mL,无菌分离血清,装入2mL离心管中,编号,用
于ELISA 检测。
6.1.3 组织样品
采取有明显病变的肺脏、心脏、脑等新鲜组织样品。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于
组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,加入0.3mL~0.5mLPBS混匀,将组织悬液转入无菌离心管
中,编号备用。
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GB/T34750—2025
6.1.4 积液
用无菌注射器采集胸腔、腹腔积液或关节液2mL~3mL,转至无菌离心管中,编号备用。
6.1.5 抗凝血
用无菌注射器先吸入抗凝剂(阿氏液)2mL~3mL,自耳静脉或前腔静脉采集等量血液,快速混匀
后转入无菌离心管中,编号备用。
6.1.6 增菌培养物
用无菌滴头吸取增菌培养物500μL于无菌离心管中,编号备用。
6.2 样品保存
样品采集后置保温箱中,加入预冷的冰袋,密封,宜24h内运送至实验室。样品在2℃~8℃条件
下保存应不超过24h。若需长期保存,应放置于-70℃。
7 细菌分离与鉴定
7.1 主要仪器设备
7.1.1 生物安全柜。
7.1.2 恒温培养箱。
7.1.3 光学显微镜。
7.1.4 全自动微生物鉴定仪。
7.1.5 2℃~8℃冰箱。
7.2 主要试剂材料
7.2.1 TSA 固体培养基和TSB液体培养基按照附录A 中A.1、A.2进行配制。
7.2.2 NAD贮存液按照A.3进行配制,2℃~8℃条件下保存。
7.2.3 革兰氏染色试剂:含草酸铵结晶紫染液、卢戈氏(Lugol)碘液、95%酒精和沙黄(蕃红)染液,常温
条件下保存。
7.2.4 无NAD的绵羊鲜血平板,葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖等微量生化鉴定管,2℃~8℃
条件下保存。
7.2.5 硝酸盐还原试验试剂、0.1%二盐酸二甲基对苯二胺溶液按照A.4、A.5配制,常温条件下保存。
7.3 分离培养
7.3.1 在生物安全柜中用接种环无菌蘸取样品划线接种于TSA 固体培养基上,37℃培养24h~48h,
使之形成菌落,以供鉴定用。
7.3.2 取7.3.1中培养的针尖大小(直径约1mm~2mm)、圆形、隆起、光滑湿润、无色透明、边缘整齐
的小菌落,在TSA 固体培养基上进行划线接种纯培养,37 ℃培养24h~48h后,出现上述小菌落(见
附录B中图B.1)。
7.4 涂片染色镜检
7.4.1 涂片:在载玻片上滴加1滴~2滴灭菌蒸馏水后,挑取纯培养的小菌落与灭菌蒸馏水混匀并涂成
薄菌膜。
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GB/T34750—2025
7.4.2 干燥:将涂片于空气中自然晾干。
7.4.3 固定:将已干燥的载玻片涂面朝上,在酒精灯火焰上通过5次~6次进行固定。
7.4.4 染色:采用革兰氏染色法进行染色,具体操作按照革兰氏染色试剂盒说明书进行,置1000倍
(10×100)光学显微镜下观察。
7.4.5 镜检:副猪格拉瑟菌为革兰氏染色阴性短杆状或球杆状小杆菌,菌体大小不等,约0.5μm×
(1.5μm~2.0μm),以纤细杆状居多、无鞭毛,不形成芽孢(见图B.2)。
7.5 “卫星生长现象”试验
在生物安全柜中无菌挑取纯化培养后的单个菌落,平行划线于无NAD的绵羊鲜血平板上,再挑取
金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线,37℃条件下培养24h~48h后,观察菌落生长情况,副猪格拉瑟菌
无溶血,并具有“卫星生长现象”(金黄色葡萄球菌周围的副猪格拉瑟菌菌落较大,而远离葡萄球菌的副
猪格拉瑟菌菌落较小)。
7.6 增殖培养
在生物安全柜中无菌挑取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落在TSA 固体培养基上进行再次
纯培养后,挑取单个菌落接种于5mLTSB液体培养基中,37℃培养24h~48h后,液体变混浊,判为
增殖培养成功。
7.7 生化鉴定
7.7.1 糖类发酵试验
在生物安全柜中无菌将生化鉴定管打开,每管按10μg/mL终浓度加入NAD,用接种针无菌挑取
7.6中增殖培养的菌液分别接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、木糖等微量生化鉴定管中,37 ℃培养
24h,观察结果,发酵葡萄糖、半乳糖,不发酵乳糖、甘露醇、木糖者为阳性,否则为阴性。
7.7.2 触酶试验
吸取7.6中增殖培养的菌液1滴于洁净玻片上,然后滴加1滴3%过氧化氢混匀,30s内观察反应
结果,立即出现大量气泡者判为阳性,无气泡者判为阴性。
7.7.3 硝酸盐还原试验
将0.8%磺胺酸冰乙酸溶液和0.5%α-萘胺乙醇溶液各0.2mL混合,取混合试剂0.1mL加至7.6
中增殖培养菌液中,立即观察结果,呈现红色者为阳性,无红色出现者为阴性。
7.7.4 尿素酶试验
吸取7.6中增殖培养的菌液100μL接种于尿素酶试验液体培养基管中,摇匀,于37℃培养10min,
60min和120min后分别观察结果,粉红色者判为阳性,不变色者判为阴性。
7.7.5 氧化酶试验
吸取7.6中增殖培养菌液1滴于洁净载玻片上,加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴,2min内观察结
果,呈现鲜蓝色者判为阳性,2min内不变色者判为阴性。
7.7.6 全自动微生物鉴定仪鉴定
按照全自动微生物鉴定仪使用说明书将7.6中增殖培养的细菌进行微生物鉴定。
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7.7.7 生化试验判定
糖类发酵试验结果为发酵葡萄糖、半乳糖,不发酵乳糖、甘露醇、木糖,触酶、硝酸盐还原试验结果均
为阳性,尿素酶、氧化酶试验结果均为阴性的判定为副猪格拉瑟菌通用型阳性;或全自动微生物鉴定仪
鉴定结果为副猪格拉瑟菌阳性的,判定为副猪格拉瑟菌通用型阳性;否则判定为通用型阴性。
7.8 结果判定
符合7.4或/和7.5判为副猪格拉瑟菌感染疑似阳性;经7.7任意一项生化鉴定为阳性者判为副猪
格拉瑟菌通用型阳性。
8 巢式PCR 检测
8.1 主要仪器设备
8.1.1 自动化核酸提取仪。
8.1.2 PCR扩增仪。
8.1.3 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
8.1.4 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。
8.1.5 凝胶成像仪(或紫外透射仪)。
8.1.6 微量可调移液器(0.1μL~0.25μL;0.5μL~10μL;2μL~20μL;20μL~200μL;100μL~
1000μL 等不同规格)。
8.2 主要试剂材料
8.2.1 用灭活的副猪格拉瑟菌标准菌株作为阳性对照,灭菌的TSB培养基作为阴性对照。
8.2.2 巢式PCR扩增用上、下游引物序列按照附录C中C.1合成。
8.3 样品DNA 的制备
采用DNA 提取试剂盒提取各类样本中的核酸,或用自动化核酸提取仪提取各类样本中核酸。如
在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存,否则应置于-20℃冰箱保存。
8.4 巢式PCR 扩增
8.4.1 第一轮PCR 扩增
8.4.1.1 配制PCR 反应体系Ⅰ
PCR反应体系Ⅰ,试剂如下:
———2.5μL10×PCR缓冲液(含Mg2+ );
———2μLdNTPs(2.5mmol/L);
———0.5μLP1;
———0.5μLP2;
———0.25μL(5U)ExTaq DNA 聚合酶;
———17.25μL灭菌双蒸水。
总体积为23μL,室温融化后,瞬时离心使液体全部聚集在管底部,向每管中加入8.3中相应样品
DNA2μL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。
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8.4.1.2 PCR 扩增条件
95℃预变性5min后;94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸45s,共35个循环;最后72℃延
伸10min。反应结束后取出置于2℃~8℃条件下保存。
8.4.2 第二轮PCR 扩增
8.4.2.1 配制PCR 反应体系Ⅱ
PCR反应体系Ⅱ,试剂如下:
———2.5μL10×PCR缓冲液(含Mg2+ );
———2μLdNTPs(2.5mmol/L);
———0.5μLP3;
———0.5μLP4;
———0.25μL(5U)ExTaq DNA 聚合酶;
———17.25μL灭菌双蒸水。
总体积为23μL,室温融化后,瞬时离心使液体全部聚集在管底部,向每管中加入8.4.1中相应样品
DNA2μL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。
8.4.2.2 PCR 扩增条件
同8.4.1.2。
8.5 PCR 扩增产物的电泳检测
称取1.2g琼脂糖加入100mL核酸电泳缓冲液中加热至沸腾,充分溶化后放凉至50℃左右,加入
核酸染色剂10μL,混匀,倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入1×TAE核酸电泳缓冲液,使液面刚
刚没过凝胶。分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物10μL和2μL6×电泳上样缓冲液混
合后,分别加样到各凝胶孔中,取5μLDNA 分子质量标准加入一凝胶孔中。5V/cm 恒压下电泳
30min左右,将电泳好的凝胶置紫外投射仪或凝胶成像系统中观察结果,进行判定并做好试验记录。
8.6 结果判定
8.6.1 试验结果成立条件
副猪格拉瑟菌阳性对照的巢式PCR 扩增产物电泳后在312bp位置出现特异性条带,同时阴性对
照的PCR扩增产物电泳后没有任何条带(见附录D中图D.1),则试验结果成立;否则结果不成立。
8.6.2 阳性判定
在试验结果成立的前提下,如果样品的PCR产物电泳后在312bp位置上出现特异性条带,判定为
副猪格拉瑟菌通用型核酸检测阳性。
8.6.3 阴性判定
在试验结果成立的前提下,如果样品在312bp位置未出现特异性条带,判定为副猪格拉瑟菌通用
型核酸检测阴性。
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9 实时荧光PCR 检测
9.1 主要仪器设备
9.1.1 自动化核酸提取仪。
9.1.2 实时荧光PCR仪。
9.1.3 台式低温高速离心机(最大离心力12000g 以上)。
9.1.4 微量可调移液器(0.1μL~0.25μL;0.5μL~10μL;2μL~20μL;20μL~200μL;100μL~
1000μL 等不同规格)。
9.2 主要试剂材料
副猪格拉瑟菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列按照C.2合成。
9.3 样品DNA 的制备
样品DNA 的制备同8.3。
9.4 实时荧光PCR 扩增
9.4.1 配制实时荧光PCR 反应体系
实时荧光PCR反应体系,试剂如下:
———2.5μL10×PCR缓冲液(含Mg2+ );
———2μLdNTPs(2.5mmol/L);
———0.5μLFQ-P1;
———0.5μLFQ-P2;
———0.5μL MGB探针;
———0.25μL(5U)ExTaq DNA 聚合酶;
———16.75μL灭菌双蒸水。
向每管中加入8.3中相应DNA2μL,充分混匀后并使液体全部聚集于管底,按照要加样品的顺序
摆放好实时荧光PCR反应管。
9.4.2 反应参数设置
第一阶段,94℃预变性5min;第二阶段,94℃变性30s,60℃延伸30s,40个循环,在每个循环的
延伸结束时进行荧光信号收集,荧光模式设为FAM/NONE双标记模式。
9.5 结果判定
9.5.1 试验成立条件
阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线,且Ct值>32.0或无;阳性对照的Ct值应≤29.0,且出
现特定的扩增曲线(见图D.2);如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件,此次实验视为无效。
9.5.2 阳性
Ct值≤29.0,而且出现特定的扩增曲线,则判定为副猪格拉瑟菌通用型阳性。
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9.5.3 阴性
Ct值>32.0或无,并且无特定的扩增曲线,则判定为副猪格拉瑟菌通用型阴性。
9.5.4 可疑
29.0<ct值≤32.0且有特定的扩增曲线的样品应重做,结果为阳性者判定为副猪格拉瑟菌通用型
阳性,否则判定为副猪格拉瑟菌通用型阴性。
10 间接ELISA
10.1 主要仪器设备
10.1.1 酶标仪。
10.1.2 恒温箱。
10.1.3 洗板机或洗涤瓶。
10.1.4 96孔酶标板。
10.1.5 U 形96孔稀释板。
10.1.6 微量可调移液器(2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格)。
10.1.7 贮液槽。
10.2 主要试剂材料
10.2.1 包被抗原:副猪格拉瑟菌重组P2蛋白,制备和鉴定见附录E。
10.2.2 酶标抗体:兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶。
10.2.3 对照:副猪格拉瑟菌抗体阳性对照(阳性血清)的制备及鉴定见附录F中F.1;阴性对照(阴性血
清)的制备及鉴定见F.2。
10.2.4 包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶结合物稀释液、终止液分别按照附录G 中G.1~G.6
配制。
10.2.5 底物溶液:商品化即用型TMB底物溶液。
10.3 操作方法
10.3.1 副猪格拉瑟菌重组P2蛋白包被板的制备
取96孔酶标板,以包被缓冲液稀释至工作浓度的副猪格拉瑟菌重组P2抗原每孔加入100μL
(0.5μg/mL),置于4℃过夜16h~22h;弃去板中包被液,每孔加入300μL洗涤液,洗1次,甩掉洗涤
液并在吸水纸上拍干残留液体;每孔加入封闭液120μL,置于37℃恒温箱内2h或置于4℃过夜16h~
22h。封闭结束后,弃去板中的封闭液,于吸水纸上拍干后,室温干燥后置于4℃干燥保存。
10.3.2 加待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清
将待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清用稀释液分别作1∶100稀释,每孔加入100μL,每个
对照血清做两孔重复,置于37℃温箱内反应60min,取出反应板,弃去反应液,每孔加入300μL洗涤
液,洗5次。
10.3.3 加酶标抗体
将兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶用样品稀释液作1∶5000稀释至工作浓度,每孔加入100μL,置于
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37℃温箱内反应30min,取出反应板,弃去反应液,洗板3次。
10.3.4 加底物溶液
每孔加入底物溶液100μL(TMB),置于37℃温箱内避光反应15min。
10.3.5 终止反应
每孔加入终止液50μL,终止反应。
10.3.6 读数
酶标仪读取各孔吸光值(OD450nm,指在波长450nm 的光密度值)。
10.4 数据分析
10.4.1 试验成立条件
阳性对照孔平均OD450nm值(PX )>0.5,阴性对照孔平均OD450nm值(NX )<0.2。
10.4.2 计算方法
阳性对照孔平均OD450nm值按照式(1)计算:
PX =(P1 +P2)/2 …………………………(1)
式中:
PX ———阳性对照孔平均OD450nm值;
P1 ———阳性对照孔1的OD450nm值;
P2 ———阳性对照孔2的OD450nm值。
阴性对照孔平均OD450nm值按照式(2)计算:
NX =(N1 +N2)/2 …………………………(2)
式中:
NX ———阴性对照孔平均OD450nm值;
N1 ———阴性对照孔1的OD450nm值;
N2 ———阴性对照孔2的OD450nm值。
计算待检血清S/PX 按照式(3)计算:
S/PX =(S -NX )/(PX -NX ) …………………………(3)
式中:
S ———样本OD450nm值;
PX ———阳性对照孔平均OD450nm值;
NX ———阴性对照孔平均OD450nm值。
10.4.3 结果判定
当样品S/PX 值≥0.40时,判定为副猪格拉瑟菌抗体阳性;当样品S/PX 值<0.40时,判定为副猪
格拉瑟菌抗体阴性。
11 综合判定
11.1 疑似
符合临床诊断(见5.4)、涂片染色镜检(见7.4)、“卫星生长现象”(见7.5)任何一项,为疑似副猪格拉
瑟菌感染。
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11.2 确诊
11.2.1 判定为疑似副猪格拉瑟菌感染病例,且细菌分离与鉴定(见7.8)、巢式PCR检测(见8.6)、实时
荧光PCR检测(见9.5)任一项阳性的,可判为副猪格拉瑟菌感染。
11.2.2 判定为疑似副猪格拉瑟菌感染病例,如动物未免疫副猪格拉瑟菌疫苗,且经间接ELISA 检测
检出抗体阳性的,可判为副猪格拉瑟菌感染。
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附 录 A
(规范性)
分离培养和生化鉴定试剂的配制
A.1 TSA 固体培养基
称取TSA40g,加入940mL蒸馏水,充分摇匀后加热至充分溶解,121 ℃高压蒸汽灭菌15min。
冷却至45℃左右,加入50mL过滤除菌的小牛血清、10mL过滤除菌的1% NAD,充分摇匀后制备固
体培养平板,2℃~8℃条件下保存。
A.2 TSB液体培养基
称取TSB30g,加入949mL蒸馏水,加热至充分溶解后摇匀,121℃高压蒸汽灭菌15min,2℃~
8℃条件下保存。使用前,加入50mL过滤除菌的小牛血清、1mL过滤除菌的1% NAD。
A.3 NAD 贮备液
称取1gNAD溶解于100mL蒸馏水中,充分摇匀溶解后,用0.22μm 的细菌滤器过滤,分装于无
菌离心管中,置于-20℃保存备用。
A.4 硝酸盐还原试验试剂
称取磺胺酸0.8g,加入100mL冰乙酸配制成0.8%磺胺酸冰乙酸溶液;称取0.5gα-萘胺,加入
100mL乙醇,配制成0.5%α-萘胺乙醇溶液。
A.5 0.1%二盐酸二甲基对苯二胺溶液
称取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g,加入10mL蒸馏水,即可配制成0.1%二盐酸二甲基对苯二胺
溶液。
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GB/T34750—2025
附 录 B
(资料性)
副猪格拉瑟菌分离鉴定图
B.1 副猪格拉瑟菌分离鉴定菌落形状图
副猪格拉瑟菌分离鉴定菌落形状见图B.1。
图B.1 副猪格拉瑟菌菌落形状
B.2 副猪格拉瑟菌涂片革兰氏染色细菌图
副猪格拉瑟菌涂片革兰氏蓝色细菌形状见图B.2。
图B.2 副猪格拉瑟菌涂片革兰氏蓝色细菌形状
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GB/T34750—2025
附 录 C
(规范性)
巢式PCR 和实时荧光PCR 所用引物序列
C.1 巢式PCR 上、下游引物序列
巢式PCR上、下游引物序列见表C.1。
表C.1 巢式PCR 上、下游引物序列
引物名称浓度/(μmol/L) 引 物 序 列扩增片段大小
第一轮PCR 扩增上游引
物P1 20 5'-TCGGTGATGAGGAAGGGTGA-3'
第一轮PCR 扩增下游引
物P2 20 5'-TCGTCACCCTCTGTATGCAC-3'
第二轮PCR 扩增上游引
物P3 20 5'-AGGGTGGTGTTTTAATAGAGCAC-3'
第二轮PCR 扩增下游引
物P4 20 5'-CACATGAGCGTCAGTATTTTCC-3'
P1/P2引物对扩增片段
820bp;
P3/P4引物对扩增片段
312bp
C.2 实时荧光PCR 上、下游引物及探针序列
实时荧光PCR上、下游引物及探针序列见表C.2。
表C.2 实时荧光PCR 上、下游引物及探针序列
引物名称浓度/(μmol/L) 引 物 序 列扩增片段大小
实时荧光PCR 扩增上游
引物FQ-P1 20 5'-AGCAGCCGCGGTAATACG-3'
实时荧光PCR 扩增下游
引物FQ-P2 20 5'-CCTTTACGCCCAGTCATTCC-3'
实时荧光PCR扩增MGB
探针10 FAM-5'-AGGGTGCGAGCGT-3'-MGB
P1/P2引物对扩增片段
820bp;
P3/P4引物对扩增片段
312bp
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GB/T34750—2025
附 录 D
(资料性)
巢式PCR 产物电泳图及荧光PCR 扩增曲线图
D.1 巢式PCR 产物电泳图
巢式PCR产物电泳图见图D.1。
标引序号说明:
M ———100bpDNALadder;
1 ———副猪格拉瑟菌阳性对照;
2 ———阴性对照。
图D.1 巢式PCR 产物电泳图
D.2 实时荧光PCR 扩增曲线图
实时荧光PCR扩增曲线图见图D.2。
图D.2 实时荧光PCR 扩增曲线图
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GB/T34750—2025
附 录 E
(资料性)
副猪格拉瑟菌重组P2蛋白的制备及鉴定
E.1 重组菌株的诱导表达与纯化
将E.coli-pET-32a-p2接种于含有Amp+(100μg/mL)LB固体培养基中,置于37℃培养过夜,挑
取单菌落接种于含Amp+(100μg/mL)LB 液体培养基,置于37 ℃、220r/min 摇床振荡培养至
OD600nm在0.5~0.6之间,取1mLE.coli-pET-32a-p2菌液作为诱导前对照,随后再加入IPTG 至终浓
度为1mmol/L,置于37 ℃、220r/min的摇床中振荡培养8h。取1mL诱导表达好的菌液至离心管
内,8000r/min离心3min,去掉上清,用PBS洗涤一次后加入30μLPBS重悬细菌,再加10μL4×
SDS蛋白上样缓冲液,混匀后煮沸10min,4℃条件下、以10000r/min离心1min,取5μL进行10%
SDS-PAGE电泳,确定在60kDa处表达出目的蛋白,用Westernblot方法分析r-p2蛋白的抗原性。收
集剩下的菌液表达并纯化r-p2蛋白,纯化后的r-p2蛋白经浓度测定,每毫升菌液表达产物的蛋白量应
不低于0.05mg。
E.2 重组表达副猪格拉瑟菌P2蛋白的反应性及特异性鉴定
将纯化的r-p2蛋白用包被缓冲液稀释成0.5μg/mL包被ELISA 板,用间接ELISA 方法测定,与
副猪格拉瑟菌体抗体阳性血清的S/N 值应≥2.1,而与非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体阳性血清、猪繁殖与
呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)抗体
阳性血清、圆环病毒2型(PCV2)抗体阳性血清、猪流行性腹泻(PEDV)抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎
病毒(TGEV)抗体阳性血清、猪δ冠状病毒(PDCoV)抗体阳性血清和pET-32a空载体大肠杆菌
BL21plysS(空载体蛋白)抗体阳性血清S/N 值<2.1。
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GB/T34750—2025
附 录 F
(资料性)
抗体阳性对照(阳性血清)、阴性对照(阴性血清)的制备及鉴定
F.1 抗体阳性对照(阳性血清)制备及鉴定
用副猪格拉瑟菌按肌肉注射方法(首次免疫加入弗氏完全佐剂,二次免疫加入弗氏不完全佐剂)免
疫小型猪,最后一次免疫2周后前腔静脉采血分离血清;用纯化r-p2蛋白包被ELISA 板检测抗体效
价,以测定孔OD值(S)/阴性对照孔OD值(N )≥2.1判为阳性,S/N <2.1判为阴性。结果测定猪血
清抗体效价为1∶16000,大量采集全血分离血清,56 ℃ 30min水浴补体灭活后分装于2mL冻存管
中,每管1mL,-70℃冰箱保存,作为副猪格拉瑟菌抗体阳性对照(阳性血清)。
F.2 抗体阴性对照(阴性血清)制备
选择副猪格拉瑟菌抗体阴性小型猪(用纯化r-p2蛋白包被ELISA 板检测抗体为阴性)采集全血,
分离血清,灭活后作为副猪格拉瑟菌抗体阴性对照(阴性血清)。
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GB/T34750—2025
附 录 G
(规范性)
间接ELISA 检测溶液配制
G.1 包被液(含0.05mol/LCBS,pH9.6)
称取碳酸钠(Na2CO3,分析纯)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO3,分析纯)2.93g,加纯化水定容至
1000mL。
G.2 洗涤液(含0.01mol/LPBS,0.05% 吐温-20,pH7.4)
称取磷酸二氢钾(KH2PO4,分析纯)0.2g、十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O,分析纯)2.89g、
氯化钠(NaCl,分析纯)8.0g、氯化钾(KCl,分析纯)0.2g、吐温-200.5mL,加纯化水至1000mL。
G.3 封闭液
称取1g牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖5g,再加洗涤液定容至100mL。
G.4 样品稀释液
称取1g酪蛋白(Casein)、氯化钠(NaCl,分析纯)5g,再加洗涤液定容至100mL。
G.5 酶结合物稀释液
称取1g牛血清白蛋白(BSA)、400μLProclin300,再加洗涤液定容至100mL。
G.6 终止液
量取蒸馏水442mL,量取硫酸(H2SO4,分析纯)58mL缓慢加入蒸馏水中。
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GB/T34750—2025</ct值≤32.0且有特定的扩增曲线的样品应重做,结果为阳性者判定为副猪格拉瑟菌通用型