SN/T 5669-2024 鸭细小病毒病检疫技术规范 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T5669—2024
鸭细小病毒病检疫技术规范
Technicalspecificationforinfectionwithduckparvovirus
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国天津海关、河北农业大学、中华人
民共和国济南海关、中华人民共和国长沙海关。
本文件主要起草人:王建昌、王金凤、陈小金、袁万哲、刘立兵、孙晓霞、曹丙蕾、朱忠武、董志珍、
员丽娟。
Ⅰ
SN/T5669—2024
鸭细小病毒病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了鸭细小病毒病的临床诊断、病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR
的技术要求。
本文件适用于鸭细小病毒病的流行病学调查、临床诊断、检疫、检测、监测等。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T2123—2008 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHQ1:黑洞淬灭基团1(Blackholequencher1)
Ct:每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数(Cyclethreshold)
DPV:鸭细小病毒(Duckparvovirus)
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)
FAM:6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein)
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersaline)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)
4 生物安全措施
鸭细小病毒病进行实验室检测时,生物安全措施应满足GB19489的规定。
5 临床诊断
5.1 疫病概述
鸭细小病毒病概述见附录A。
1
SN/T5669—2024
5.2 临床症状
喙萎缩变形、舌肿胀、外伸而向下弯曲;生长发育严重迟缓,软脚、跛行甚至瘫痪;骨质疏松,翅部骨
骼、胫骨和肋骨质地变脆;部分病鸭有腹泻现象,排白色或黄白色稀粪。
5.3 病理变化
舌肿大,出现间质性炎症,舌部结缔组织疏松、水肿;胸腺肿大、充血和/或出血;肠道卡他性炎症,肠
黏膜充血和/或轻微出血,严重时可导致肠黏膜脱落,在肠道中形成肠栓。
5.4 结果判定
当病鸭出现上述临床症状和病理变化时,可初步判定为疑似鸭细小病毒病。
6 样品采集与处理
6.1 器材
6.1.1 手术剪刀和镊子。
6.1.2 1.5mL和2mL离心管。
6.1.3 10mL灭菌保存管或无菌采样袋。
6.1.4 无菌棉拭子。
6.1.5 2mL灭菌注射器。
6.1.6 防水标签、记号笔。
6.1.7 组织匀浆器。
6.2 试剂
6.2.1 水:本文件所用水应符合GB/T6682中三级水的规格。
6.2.2 0.01mol/LPBS(pH7.4),按照附录B中B.1配制。
6.2.3 青霉素,浓度为10000IU/mL,按照B.2配制。
6.2.4 链霉素,质量浓度为10mg/mL,按照B.3配制。
6.3 样品采集
6.3.1 泄殖腔拭子样品采集
将棉拭子深入泄殖腔至少旋转三圈并蘸取少量粪便。将采样后的泄殖腔拭子放入盛有2.0mL含
2000IU/mL青霉素和2mg/mL链霉素的PBS(0.01moL/L,pH7.4)采样管中,编号,于2℃~8℃冷
藏或-20℃冷冻保存。
6.3.2 组织样品采集
无菌采集临床发病鸭的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等,装入无菌采样袋或其他灭菌容器并编号,于
2℃~8℃冷藏或-20℃冷冻保存。
6.4 样品运输与保存
样品运输和保存应满足SN/T2123—2008第5章和第6章的相关要求。样品采集后置样品运输
箱中,加入预冷的冰袋,密封,宜24h内送实验室。样品送达实验室后,在2 ℃~8 ℃条件下保存应不
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SN/T5669—2024
超过24h;若需长期保存,应在-70℃以下保存,避免反复冻融。
6.5 样品处理
6.5.1 泄殖腔拭子样品处理
将采集的拭子样品在振荡器上充分混匀,将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子,3000r/min,4 ℃
离心10min,取上清液转入无菌1.5mL离心管中。如果进行病毒分离,则经0.22μm 滤器过滤再分装
至离心管中。弃去拭子使用压力蒸汽灭菌器(121℃,30min)进行无害化处理。
6.5.2 组织样品处理
用无菌剪刀和镊子剪取待检样品,置组织匀浆器充分研磨,置于含2000IU/mL 青霉素和
2mg/mL链霉素的PBS(0.01 moL/L,pH7.4)中,制成10% ~20% 悬浮液,冻融2 次~3 次,
3000r/min,4℃离心10min,取上清液转入无菌1.5mL离心管中。如果进行病毒分离,则经0.22μm
滤器过滤再分装至离心管中。
7 病毒分离鉴定
7.1 器材
7.1.1 Ⅱ级生物安全柜。
7.1.2 组织研磨仪或研钵。
7.1.3 冷冻离心机。
7.1.4 照蛋器。
7.1.5 打孔器。
7.1.6 酒精灯。
7.1.7 冰箱。
7.1.8 9日龄~11日龄SPF鸭胚。
7.2 试剂
7.2.1 PBS(0.01moL/L,pH7.4),按照B.1配制。
7.3 病毒分离
7.3.1 将9日龄~11日龄SPF鸭胚用照蛋器照视检查,并用铅笔画出气室与胚胎位置,在气室边缘上
2mm~8mm 处避开血管做一标记,并在鸭胚绒毛尿囊膜血管相对较少一侧气室做标记。
7.3.2 将鸭胚竖放在蛋座上,钝端(气室)向上。用5%碘酊消毒蛋壳气室后,用70%的酒精脱碘消
毒,用无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔(勿损伤壳膜)。
7.3.3 用1.0mL注射器吸取0.2mL处理好的样品上清液,针头刺入孔内,经绒毛尿囊膜注入尿囊
腔,如图1所示。每个样品接种5个鸭胚。
3
SN/T5669—2024
图1 鸭胚尿囊腔接种法
7.3.4 接种后,加热熔化石蜡封孔,于37℃~38℃孵化箱内孵育,18h后开始观察鸭胚死亡情况,24h
内死亡的鸭胚弃用,随后每隔12h观察一次,记录鸭胚死亡情况。
7.3.5 对24h以后死亡鸭胚以及96h后仍存活的鸭胚,于4 ℃冷却4h~12h后,无菌收取尿囊
液,于-20℃冷冻保存。
7.3.6 将收获的尿囊液进行PCR或实时荧光PCR方法检测,阴性尿囊液按照上述方法盲传至5代。
7.4 病毒鉴定
使用鸭胚尿囊液,按照本文件提供的PCR或实时荧光PCR方法进行病毒鉴定,出现特异性核酸扩
增,可鉴定为鸭细小病毒。
8 聚合酶链式反应(PCR)
8.1 设备
8.1.1 PCR仪。
8.1.2 台式低温高速离心机。
8.1.3 电泳仪和电泳槽。
8.1.4 凝胶成像系统。
8.1.5 Ⅱ级生物安全柜。
8.1.6 微量可调移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格),及其配套的无核酸酶处理的离心
管和吸头。
8.2 试剂和材料
8.2.1 病毒DNA 提取试剂盒。
8.2.2 PCR预混液(2×)。
8.2.3 1×TAE缓冲液(配制方法按照B.4和B.5)。
8.2.4 1.5%琼脂糖凝胶(配制方法按照B.6)。
8.2.5 DNA 分子质量标准(分子大小范围100bp~1000bp)。
8.2.6 空白对照(ddH2O)。
8.2.7 阴性对照(正常鸭胚尿囊液或正常鸭组织脏器)。
8.2.8 阳性对照(含有DPV 的鸭组织脏器、尿囊液或含有目的扩增片段的质粒)。
8.2.9 引物:
上游引物DPV-decF:5'-AACTTACCAAGGCCCGTTCCTG-3',下游引物DPV-decR:5'-
GCGACGCTGTCCGCCTTGTTGA-3',扩增产物大小为659bp,扩增片段位于鸭细小病毒Rep基因和
VP1基因的保守区域。
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SN/T5669—2024
8.3 病毒DNA 提取
采用DNA 提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸,或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病
毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存,否则应置于-20℃冷冻保存。
每次抽提核酸,应包括一个阳性对照和一个阴性对照。
8.4 PCR 检测
8.4.1 PCR 反应体系
在体系配制区进行PCR反应体系配制。检测DPV 的PCR体系见表1。每次进行PCR检测应设
立阳性、阴性和空白对照。阳性对照应用阳性对照样品提取核酸作为模板,阴性对照应用阴性对照样品
提取核酸作为模板,空白对照应用去离子水作为模板。加入模板后充分混匀,瞬时离心,使液体沉降到
PCR管底。
表1 PCR 反应体系
名称加样体积/μL
PCR预混液(2×) 12.5
DPV-decF(10μmol/L) 1
DPV-decR(10μmol/L) 1
模板DNA 2
灭菌去离子水8.5
反应体系总体积25
8.4.2 反应条件
PCR反应参数:95℃预变性5min;95℃30s、55℃30s、72℃40s,35个循环;72℃延伸10min。
8.4.3 PCR 扩增产物电泳
制备含核酸染料质量浓度为1.0μg/mL的1.5%琼脂糖凝胶板,在电泳槽中加入1×TAE电泳缓
冲液,使液面刚刚没过凝胶。取10μLPCR产物,与2.0μL6×加样缓冲液混合,加入琼脂糖凝胶板的
加样孔中,同时加入DNA 分子质量标准。盖好电泳仪,插上电极,以10V/cm 恒压电泳,至溴酚蓝指示
剂迁移经过凝胶约2/3长度时结束电泳。将凝胶置于凝胶成像仪下观察电泳结果,并做好记录。
8.5 试验成立条件
阳性对照扩增出大小为659bp的特异性扩增条带,且阴性对照和空白对照无扩增条带。否则,此
次试验视为无效,应重新试验。
8.6 PCR 结果判定
符合8.5的条件,被检样品有大小为659bp的特异性扩增条带,则初步判定为鸭细小病毒核酸阳
性;被检样品无特异性扩增条带,则判定为鸭细小病毒核酸阴性。检测为核酸阳性的样品,其PCR产物
进行测序分析,将测序结果与标准参考序列(见附录C)进行比对,序列一致性达98%以上,则判为鸭细
小病毒核酸阳性。
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SN/T5669—2024
9 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)
9.1 设备
9.1.1 荧光PCR仪。
9.1.2 台式低温高速离心机。
9.1.3 Ⅱ级生物安全柜。
9.1.4 冰箱。
9.1.5 微量可调移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格),及其配套的无核酸酶处理的离心
管和吸头。
9.2 试剂和材料
9.2.1 病毒DNA 提取试剂盒。
9.2.2 荧光PCR预混液(2×)。
9.2.3 空白对照(ddH2O)。
9.2.4 阴性对照(正常鸭胚尿囊液或正常鸭组织脏器)。
9.2.5 阳性对照(含有DPV 的鸭组织脏器、尿囊液或含有目的扩增片段的质粒)。
9.2.6 引物探针:
上游引物DPV-qF:5'-CAAATTCCATCCTTCTCCAAATCT-3',下游引物DPV-qR:5'-TCTGCAGGTACTGGTGTATTCTTGA-
3'),探针DPV-qP:5'-FAM-CTGCACAATCCACCACCACAGGTCTTC-
BHQ1-3',扩增片段位于鸭细小病毒VP3基因的保守区域。
9.3 病毒DNA 提取
方法同8.3。
9.4 实时荧光PCR 检测
9.4.1 实时荧光PCR 反应体系
在体系配制区进行实时荧光PCR体系配制,检测DPV 的实时荧光PCR 体系见表2。阳性、阴性
和空白对照的设置同8.4.1。加入模板后充分混匀,瞬时离心,使液体沉降到PCR管底。
表2 实时荧光PCR 反应体系
名称加样体积/μL
荧光PCR预混液(2×) 12.5
DPV-qF(10μmol/L) 0.9
DPV-qR(10μmol/L) 0.9
DPV-qP(10μmol/L) 0.6
模板DNA 2
灭菌去离子水8.1
反应体系总体积25
6
SN/T5669—2024
9.4.2 实时荧光PCR 反应条件
荧光PCR反应参数:95℃预变性30s;95℃5s、60℃35s,35个循环。在每一个循环的60℃收
集FAM 荧光信号。
9.5 结果判定
9.5.1 阈值设定
检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调
整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
9.5.2 质控标准
阳性对照Ct值<30.0,并出现典型的S型扩增曲线;阴性对照无Ct值或Ct值≥35,并且无扩增曲
线。否则,此次试验视为无效,应重新试验。
9.5.3 结果描述及判定
符合9.5.2的条件,被检样品Ct值≤32,且出现典型的扩增曲线,则判定为鸭细小病毒核酸阳性;
被检样品无Ct值,或Ct值≥35,并且无扩增曲线,则判定为鸭细小病毒核酸阴性;被检样品Ct值在
32~35之间,且出现典型扩增曲线,则需要重新检测。若重新检测Ct<35,则判为阳性,无Ct值或Ct
值≥35,则判为阴性。
10 综合判定
10.1 经5.4判定为疑似鸭细小病毒病,按第7章分离出鸭细小病毒,或经第8章PCR方法、第9章实
时荧光PCR方法任一项检测出鸭细小病毒核酸阳性的,可判定为鸭细小病毒病。
10.2 无明显临床症状的易感动物,按第7章分离出鸭细小病毒,或经第8章PCR方法、第9章实时荧
光PCR方法任一项检测出鸭细小病毒核酸阳性的,可判定为鸭细小病毒感染。
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SN/T5669—2024
附 录 A
(资料性)
鸭细小病毒病概述
A.1 病原学
鸭细小病毒病(Infectionwithduckparvovirus)又称为鸭短喙侏儒综合征(Duckbeakatrophyand
dwarfismsyndrome,BADS),是由鸭细小病毒(Duckparvovirus,DPV)引起的鸭的一种以生长发育严
重迟缓、上下喙萎缩、舌外伸肿胀、骨质疏松为主要特征的传染病。鸭细小病毒,又称为新型鹅细小病
毒、鸭源鹅细小病毒,属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus),
为二十面体对称的球型或六角形,无囊膜,单链DNA 病毒,直径为20nm~25nm。基因组大
小约5.0kb,只有一个血清型。
A.2 流行病学
易感动物主要包括10日龄~30日龄以内的肉鸭,包括北京鸭、樱桃谷鸭、番鸭、半番鸭、白改鸭、麻
鸭等,发病率一般为10%~30%,病死率一般小于3%。该病传染源主要是发病鸭和带毒鸭,主要通过
消化道传播和接触传播,病毒广泛存在于鸭心、舌、肝、脾、肺、肾、法氏囊等器官。
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SN/T5669—2024
附 录 B
(规范性)
试剂配制
B.1 磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.90g
磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20g
氯化钠(NaCl)8.0g
氯化钾(KCl)0.20g
加双蒸水至1000mL,调pH 为7.4,121℃高压灭菌20min,4℃保存。
B.2 青霉素溶液
用无菌双蒸水配制,使青霉素浓度为10000IU/mL。经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌,分装,
-20℃保存,有效期3个月。
B.3 链霉素溶液
用无菌双蒸水配制,使链霉素质量浓度为10 mg/ mL。经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌,分装,
-20℃保存,有效期3个月。
B.4 50×TAE电泳缓冲液
B.4.1 0.5mol/L 乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(pH8.0)
称取二水乙二胺四乙酸钠1.44g,使用80mL双蒸水充分溶解,使用氢氧化钠溶液调pH 至8.0,加
双蒸水至100mL,室温保存。
B.4.2 TAE电泳缓冲液(50×)
羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸57.1mL
0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0) 100mL
加双蒸水至1000mL,室温保存。
B.5 1×TAE电泳缓冲液
使用前将50×TAE电泳缓冲液作50倍稀释即可。
B.6 1.5%琼脂糖凝胶
称取琼脂糖1.5g,使用1×TAE 电泳缓冲液100 mL 充分溶解,微波炉中完全融化,待冷却至
50℃~60℃时,加入溴化乙锭(EB)或核酸染料溶液5μL,摇匀,倒入电泳板上,凝固后取下梳子,
备用。
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SN/T5669—2024
附 录 C
(资料性)
PCR 扩增产物参考序列
AACTTACCAAGGCCCGTTCCTGaacgagcgaacgagccagaggagcctcctaaaatctgggctcctcctactagggagga
gttagaagagcttttaagagccagcccagaattgttctcatcagttgctccaattcctgtgactcctcagaactcccctgagcctaagagaagcaagaac
acttaccaggtacggtgtgctttgcatacttatgacaattctatggatgtgtttcaatgtatggaatgtgagaaggcaaattttcctgaatttcaacctctg
ggagaaaattactgttatgaacatgggtggtatgattgtgctatatgtacagaattgaaagatgaacttgcagaaattgagcatgcgtttgagcttgat
gatgctgaaaatgaacaataaagatgattcaaaacagatatgtctacttttttagattcttttgaagagtggtatgagactgcagccgcctcgtggcgga
atctgaaagctggagcccctcagccaaaaccaaaccagcagtctcagtctgtgtctccagacagagaacccgaacgaagagataataatcggggcttt
gtacttcctggctataagtatcttgggcctggtaacggccttgataaaggcccacctgTCAACAAGGCGGACAGCGTCGC
注:大写部分为引物扩增匹配区。
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Technicalspecificationforinfectionwithduckparvovirus
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国天津海关、河北农业大学、中华人
民共和国济南海关、中华人民共和国长沙海关。
本文件主要起草人:王建昌、王金凤、陈小金、袁万哲、刘立兵、孙晓霞、曹丙蕾、朱忠武、董志珍、
员丽娟。
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鸭细小病毒病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了鸭细小病毒病的临床诊断、病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR
的技术要求。
本文件适用于鸭细小病毒病的流行病学调查、临床诊断、检疫、检测、监测等。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T2123—2008 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHQ1:黑洞淬灭基团1(Blackholequencher1)
Ct:每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数(Cyclethreshold)
DPV:鸭细小病毒(Duckparvovirus)
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)
FAM:6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein)
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersaline)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)
4 生物安全措施
鸭细小病毒病进行实验室检测时,生物安全措施应满足GB19489的规定。
5 临床诊断
5.1 疫病概述
鸭细小病毒病概述见附录A。
1
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5.2 临床症状
喙萎缩变形、舌肿胀、外伸而向下弯曲;生长发育严重迟缓,软脚、跛行甚至瘫痪;骨质疏松,翅部骨
骼、胫骨和肋骨质地变脆;部分病鸭有腹泻现象,排白色或黄白色稀粪。
5.3 病理变化
舌肿大,出现间质性炎症,舌部结缔组织疏松、水肿;胸腺肿大、充血和/或出血;肠道卡他性炎症,肠
黏膜充血和/或轻微出血,严重时可导致肠黏膜脱落,在肠道中形成肠栓。
5.4 结果判定
当病鸭出现上述临床症状和病理变化时,可初步判定为疑似鸭细小病毒病。
6 样品采集与处理
6.1 器材
6.1.1 手术剪刀和镊子。
6.1.2 1.5mL和2mL离心管。
6.1.3 10mL灭菌保存管或无菌采样袋。
6.1.4 无菌棉拭子。
6.1.5 2mL灭菌注射器。
6.1.6 防水标签、记号笔。
6.1.7 组织匀浆器。
6.2 试剂
6.2.1 水:本文件所用水应符合GB/T6682中三级水的规格。
6.2.2 0.01mol/LPBS(pH7.4),按照附录B中B.1配制。
6.2.3 青霉素,浓度为10000IU/mL,按照B.2配制。
6.2.4 链霉素,质量浓度为10mg/mL,按照B.3配制。
6.3 样品采集
6.3.1 泄殖腔拭子样品采集
将棉拭子深入泄殖腔至少旋转三圈并蘸取少量粪便。将采样后的泄殖腔拭子放入盛有2.0mL含
2000IU/mL青霉素和2mg/mL链霉素的PBS(0.01moL/L,pH7.4)采样管中,编号,于2℃~8℃冷
藏或-20℃冷冻保存。
6.3.2 组织样品采集
无菌采集临床发病鸭的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等,装入无菌采样袋或其他灭菌容器并编号,于
2℃~8℃冷藏或-20℃冷冻保存。
6.4 样品运输与保存
样品运输和保存应满足SN/T2123—2008第5章和第6章的相关要求。样品采集后置样品运输
箱中,加入预冷的冰袋,密封,宜24h内送实验室。样品送达实验室后,在2 ℃~8 ℃条件下保存应不
2
SN/T5669—2024
超过24h;若需长期保存,应在-70℃以下保存,避免反复冻融。
6.5 样品处理
6.5.1 泄殖腔拭子样品处理
将采集的拭子样品在振荡器上充分混匀,将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子,3000r/min,4 ℃
离心10min,取上清液转入无菌1.5mL离心管中。如果进行病毒分离,则经0.22μm 滤器过滤再分装
至离心管中。弃去拭子使用压力蒸汽灭菌器(121℃,30min)进行无害化处理。
6.5.2 组织样品处理
用无菌剪刀和镊子剪取待检样品,置组织匀浆器充分研磨,置于含2000IU/mL 青霉素和
2mg/mL链霉素的PBS(0.01 moL/L,pH7.4)中,制成10% ~20% 悬浮液,冻融2 次~3 次,
3000r/min,4℃离心10min,取上清液转入无菌1.5mL离心管中。如果进行病毒分离,则经0.22μm
滤器过滤再分装至离心管中。
7 病毒分离鉴定
7.1 器材
7.1.1 Ⅱ级生物安全柜。
7.1.2 组织研磨仪或研钵。
7.1.3 冷冻离心机。
7.1.4 照蛋器。
7.1.5 打孔器。
7.1.6 酒精灯。
7.1.7 冰箱。
7.1.8 9日龄~11日龄SPF鸭胚。
7.2 试剂
7.2.1 PBS(0.01moL/L,pH7.4),按照B.1配制。
7.3 病毒分离
7.3.1 将9日龄~11日龄SPF鸭胚用照蛋器照视检查,并用铅笔画出气室与胚胎位置,在气室边缘上
2mm~8mm 处避开血管做一标记,并在鸭胚绒毛尿囊膜血管相对较少一侧气室做标记。
7.3.2 将鸭胚竖放在蛋座上,钝端(气室)向上。用5%碘酊消毒蛋壳气室后,用70%的酒精脱碘消
毒,用无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔(勿损伤壳膜)。
7.3.3 用1.0mL注射器吸取0.2mL处理好的样品上清液,针头刺入孔内,经绒毛尿囊膜注入尿囊
腔,如图1所示。每个样品接种5个鸭胚。
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图1 鸭胚尿囊腔接种法
7.3.4 接种后,加热熔化石蜡封孔,于37℃~38℃孵化箱内孵育,18h后开始观察鸭胚死亡情况,24h
内死亡的鸭胚弃用,随后每隔12h观察一次,记录鸭胚死亡情况。
7.3.5 对24h以后死亡鸭胚以及96h后仍存活的鸭胚,于4 ℃冷却4h~12h后,无菌收取尿囊
液,于-20℃冷冻保存。
7.3.6 将收获的尿囊液进行PCR或实时荧光PCR方法检测,阴性尿囊液按照上述方法盲传至5代。
7.4 病毒鉴定
使用鸭胚尿囊液,按照本文件提供的PCR或实时荧光PCR方法进行病毒鉴定,出现特异性核酸扩
增,可鉴定为鸭细小病毒。
8 聚合酶链式反应(PCR)
8.1 设备
8.1.1 PCR仪。
8.1.2 台式低温高速离心机。
8.1.3 电泳仪和电泳槽。
8.1.4 凝胶成像系统。
8.1.5 Ⅱ级生物安全柜。
8.1.6 微量可调移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格),及其配套的无核酸酶处理的离心
管和吸头。
8.2 试剂和材料
8.2.1 病毒DNA 提取试剂盒。
8.2.2 PCR预混液(2×)。
8.2.3 1×TAE缓冲液(配制方法按照B.4和B.5)。
8.2.4 1.5%琼脂糖凝胶(配制方法按照B.6)。
8.2.5 DNA 分子质量标准(分子大小范围100bp~1000bp)。
8.2.6 空白对照(ddH2O)。
8.2.7 阴性对照(正常鸭胚尿囊液或正常鸭组织脏器)。
8.2.8 阳性对照(含有DPV 的鸭组织脏器、尿囊液或含有目的扩增片段的质粒)。
8.2.9 引物:
上游引物DPV-decF:5'-AACTTACCAAGGCCCGTTCCTG-3',下游引物DPV-decR:5'-
GCGACGCTGTCCGCCTTGTTGA-3',扩增产物大小为659bp,扩增片段位于鸭细小病毒Rep基因和
VP1基因的保守区域。
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8.3 病毒DNA 提取
采用DNA 提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸,或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病
毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存,否则应置于-20℃冷冻保存。
每次抽提核酸,应包括一个阳性对照和一个阴性对照。
8.4 PCR 检测
8.4.1 PCR 反应体系
在体系配制区进行PCR反应体系配制。检测DPV 的PCR体系见表1。每次进行PCR检测应设
立阳性、阴性和空白对照。阳性对照应用阳性对照样品提取核酸作为模板,阴性对照应用阴性对照样品
提取核酸作为模板,空白对照应用去离子水作为模板。加入模板后充分混匀,瞬时离心,使液体沉降到
PCR管底。
表1 PCR 反应体系
名称加样体积/μL
PCR预混液(2×) 12.5
DPV-decF(10μmol/L) 1
DPV-decR(10μmol/L) 1
模板DNA 2
灭菌去离子水8.5
反应体系总体积25
8.4.2 反应条件
PCR反应参数:95℃预变性5min;95℃30s、55℃30s、72℃40s,35个循环;72℃延伸10min。
8.4.3 PCR 扩增产物电泳
制备含核酸染料质量浓度为1.0μg/mL的1.5%琼脂糖凝胶板,在电泳槽中加入1×TAE电泳缓
冲液,使液面刚刚没过凝胶。取10μLPCR产物,与2.0μL6×加样缓冲液混合,加入琼脂糖凝胶板的
加样孔中,同时加入DNA 分子质量标准。盖好电泳仪,插上电极,以10V/cm 恒压电泳,至溴酚蓝指示
剂迁移经过凝胶约2/3长度时结束电泳。将凝胶置于凝胶成像仪下观察电泳结果,并做好记录。
8.5 试验成立条件
阳性对照扩增出大小为659bp的特异性扩增条带,且阴性对照和空白对照无扩增条带。否则,此
次试验视为无效,应重新试验。
8.6 PCR 结果判定
符合8.5的条件,被检样品有大小为659bp的特异性扩增条带,则初步判定为鸭细小病毒核酸阳
性;被检样品无特异性扩增条带,则判定为鸭细小病毒核酸阴性。检测为核酸阳性的样品,其PCR产物
进行测序分析,将测序结果与标准参考序列(见附录C)进行比对,序列一致性达98%以上,则判为鸭细
小病毒核酸阳性。
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9 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)
9.1 设备
9.1.1 荧光PCR仪。
9.1.2 台式低温高速离心机。
9.1.3 Ⅱ级生物安全柜。
9.1.4 冰箱。
9.1.5 微量可调移液器(10μL、100μL、200μL、1mL等不同规格),及其配套的无核酸酶处理的离心
管和吸头。
9.2 试剂和材料
9.2.1 病毒DNA 提取试剂盒。
9.2.2 荧光PCR预混液(2×)。
9.2.3 空白对照(ddH2O)。
9.2.4 阴性对照(正常鸭胚尿囊液或正常鸭组织脏器)。
9.2.5 阳性对照(含有DPV 的鸭组织脏器、尿囊液或含有目的扩增片段的质粒)。
9.2.6 引物探针:
上游引物DPV-qF:5'-CAAATTCCATCCTTCTCCAAATCT-3',下游引物DPV-qR:5'-TCTGCAGGTACTGGTGTATTCTTGA-
3'),探针DPV-qP:5'-FAM-CTGCACAATCCACCACCACAGGTCTTC-
BHQ1-3',扩增片段位于鸭细小病毒VP3基因的保守区域。
9.3 病毒DNA 提取
方法同8.3。
9.4 实时荧光PCR 检测
9.4.1 实时荧光PCR 反应体系
在体系配制区进行实时荧光PCR体系配制,检测DPV 的实时荧光PCR 体系见表2。阳性、阴性
和空白对照的设置同8.4.1。加入模板后充分混匀,瞬时离心,使液体沉降到PCR管底。
表2 实时荧光PCR 反应体系
名称加样体积/μL
荧光PCR预混液(2×) 12.5
DPV-qF(10μmol/L) 0.9
DPV-qR(10μmol/L) 0.9
DPV-qP(10μmol/L) 0.6
模板DNA 2
灭菌去离子水8.1
反应体系总体积25
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9.4.2 实时荧光PCR 反应条件
荧光PCR反应参数:95℃预变性30s;95℃5s、60℃35s,35个循环。在每一个循环的60℃收
集FAM 荧光信号。
9.5 结果判定
9.5.1 阈值设定
检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调
整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
9.5.2 质控标准
阳性对照Ct值<30.0,并出现典型的S型扩增曲线;阴性对照无Ct值或Ct值≥35,并且无扩增曲
线。否则,此次试验视为无效,应重新试验。
9.5.3 结果描述及判定
符合9.5.2的条件,被检样品Ct值≤32,且出现典型的扩增曲线,则判定为鸭细小病毒核酸阳性;
被检样品无Ct值,或Ct值≥35,并且无扩增曲线,则判定为鸭细小病毒核酸阴性;被检样品Ct值在
32~35之间,且出现典型扩增曲线,则需要重新检测。若重新检测Ct<35,则判为阳性,无Ct值或Ct
值≥35,则判为阴性。
10 综合判定
10.1 经5.4判定为疑似鸭细小病毒病,按第7章分离出鸭细小病毒,或经第8章PCR方法、第9章实
时荧光PCR方法任一项检测出鸭细小病毒核酸阳性的,可判定为鸭细小病毒病。
10.2 无明显临床症状的易感动物,按第7章分离出鸭细小病毒,或经第8章PCR方法、第9章实时荧
光PCR方法任一项检测出鸭细小病毒核酸阳性的,可判定为鸭细小病毒感染。
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附 录 A
(资料性)
鸭细小病毒病概述
A.1 病原学
鸭细小病毒病(Infectionwithduckparvovirus)又称为鸭短喙侏儒综合征(Duckbeakatrophyand
dwarfismsyndrome,BADS),是由鸭细小病毒(Duckparvovirus,DPV)引起的鸭的一种以生长发育严
重迟缓、上下喙萎缩、舌外伸肿胀、骨质疏松为主要特征的传染病。鸭细小病毒,又称为新型鹅细小病
毒、鸭源鹅细小病毒,属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus),
为二十面体对称的球型或六角形,无囊膜,单链DNA 病毒,直径为20nm~25nm。基因组大
小约5.0kb,只有一个血清型。
A.2 流行病学
易感动物主要包括10日龄~30日龄以内的肉鸭,包括北京鸭、樱桃谷鸭、番鸭、半番鸭、白改鸭、麻
鸭等,发病率一般为10%~30%,病死率一般小于3%。该病传染源主要是发病鸭和带毒鸭,主要通过
消化道传播和接触传播,病毒广泛存在于鸭心、舌、肝、脾、肺、肾、法氏囊等器官。
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附 录 B
(规范性)
试剂配制
B.1 磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.4)
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.90g
磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20g
氯化钠(NaCl)8.0g
氯化钾(KCl)0.20g
加双蒸水至1000mL,调pH 为7.4,121℃高压灭菌20min,4℃保存。
B.2 青霉素溶液
用无菌双蒸水配制,使青霉素浓度为10000IU/mL。经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌,分装,
-20℃保存,有效期3个月。
B.3 链霉素溶液
用无菌双蒸水配制,使链霉素质量浓度为10 mg/ mL。经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌,分装,
-20℃保存,有效期3个月。
B.4 50×TAE电泳缓冲液
B.4.1 0.5mol/L 乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(pH8.0)
称取二水乙二胺四乙酸钠1.44g,使用80mL双蒸水充分溶解,使用氢氧化钠溶液调pH 至8.0,加
双蒸水至100mL,室温保存。
B.4.2 TAE电泳缓冲液(50×)
羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸57.1mL
0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0) 100mL
加双蒸水至1000mL,室温保存。
B.5 1×TAE电泳缓冲液
使用前将50×TAE电泳缓冲液作50倍稀释即可。
B.6 1.5%琼脂糖凝胶
称取琼脂糖1.5g,使用1×TAE 电泳缓冲液100 mL 充分溶解,微波炉中完全融化,待冷却至
50℃~60℃时,加入溴化乙锭(EB)或核酸染料溶液5μL,摇匀,倒入电泳板上,凝固后取下梳子,
备用。
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附 录 C
(资料性)
PCR 扩增产物参考序列
AACTTACCAAGGCCCGTTCCTGaacgagcgaacgagccagaggagcctcctaaaatctgggctcctcctactagggagga
gttagaagagcttttaagagccagcccagaattgttctcatcagttgctccaattcctgtgactcctcagaactcccctgagcctaagagaagcaagaac
acttaccaggtacggtgtgctttgcatacttatgacaattctatggatgtgtttcaatgtatggaatgtgagaaggcaaattttcctgaatttcaacctctg
ggagaaaattactgttatgaacatgggtggtatgattgtgctatatgtacagaattgaaagatgaacttgcagaaattgagcatgcgtttgagcttgat
gatgctgaaaatgaacaataaagatgattcaaaacagatatgtctacttttttagattcttttgaagagtggtatgagactgcagccgcctcgtggcgga
atctgaaagctggagcccctcagccaaaaccaaaccagcagtctcagtctgtgtctccagacagagaacccgaacgaagagataataatcggggcttt
gtacttcctggctataagtatcttgggcctggtaacggccttgataaaggcccacctgTCAACAAGGCGGACAGCGTCGC
注:大写部分为引物扩增匹配区。
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